豬呼吸道上皮細胞體外分化模型的建立及其應用研究.pdf

1、背景:目前體外分化的人呼吸道上皮細胞(Human airway epithelial cell，HAEC)已被廣泛應用于新發(fā)呼吸道病毒的鑒定、宿主與呼吸道病原體間相互作用和呼吸系統(tǒng)疾病的研究中。豬是許多人呼吸道病毒感染的天然宿主，在肺生理學、呼吸道形態(tài)學和呼吸道細胞類型以及受體分布都與人類有相似之處，因此豬可作為研究呼吸道病毒感染和呼吸系統(tǒng)疾病藥物篩選的理想模型。
　　目的:構建豬呼吸道上皮細胞（Porcine airway ep

2、ithelial cell，PAEC）體外分化模型，鑒定其形態(tài)學和生理學特征及其在轉導外源基因方面的應用。
　　方法:本研究采用蛋白酶低溫消化分離豬氣管和支氣管上皮細胞，接種至Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白包被的細胞培養(yǎng)皿中，使用添加多種細胞生長因子的無血清培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)。細胞接種至Ⅳ型膠原蛋白包被的半透膜支持物上，采用氣液界面培養(yǎng)法進行豬呼吸道上皮細胞的體外分化培養(yǎng)。采用掃描電鏡法、電生理和免疫組化等方法檢測和鑒定培養(yǎng)物的細胞組成和形態(tài)學

3、特性以及其表面典型的細胞標志蛋白。腺相關病毒(Adenoassociated virus，AAV)具有免疫原性低和可介導外源基因長期表達的特性，在基因治療領域有廣闊的應用空間。本實驗研究中將pXX680，pXR6，PSC-GFP三種質(zhì)粒按照6∶5∶3的比例轉染至293T細胞，培養(yǎng)48h后，收獲含重組腺相關病毒rAAV6-GFP的293T細胞。利用兩步氯化銫梯度離心純化重組rAAV6-GFP病毒并感染分化成熟的豬呼吸道上皮細胞，研究AAV

4、6在該模型上的轉導效率，驗證AAV6能否有效地介導外源基因表達。
　　結果:結果顯示分化成熟的PAEC模型為多層上皮結構，其頂端表面含有纖毛細胞、黏液分泌細胞和基底層細胞。PAEC模型的電生理學特性-上皮細胞跨膜電阻在一定時期內(nèi)保持穩(wěn)定，表明PAEC細胞間連接的形成和跨細胞間離子運輸?shù)钠胶?。本研究通過三質(zhì)粒共轉染法成功制備了重組腺相關病毒rAAV6-GFP，其能夠通過頂端表面感染PAEC，有效地轉導呼吸道上皮細胞。
　　結論