大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞體外分離、定向分化及胰島移植研究.pdf

1、第一部分:大鼠胰腺次全切除后導(dǎo)管上皮細(xì)胞增殖與Pdx-1表達(dá)規(guī)律及意義 1.大鼠胰腺次全切除后導(dǎo)管上皮細(xì)胞增殖規(guī)律 目的：研究大鼠胰腺大部分切除術(shù)后，殘余胰腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞增殖的時(shí)空規(guī)律，明確成年胰腺組織中干細(xì)胞定位。方法：手術(shù)切除大鼠胰腺體尾部約90％組縱，保留十二指腸降部胰腺組織，不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物后取材，免疫組織化學(xué)染色行BrdU標(biāo)記，觀察不同分類胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞及腺泡細(xì)胞著色比例并計(jì)算染色指數(shù)。結(jié)果：建模后第1

2、天主胰管、大胰管、小胰管細(xì)胞均出現(xiàn)增殖高峰，其中小胰管增殖持續(xù)到大鼠建模后第5天，與對(duì)照組比較有極顯著性差異(P＜0.01)；而腺泡細(xì)胞僅在建模后第5天出現(xiàn)小的增殖峰；建模后第7天破壞的胰腺小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，胰腺導(dǎo)管周圍有新生胰島形成。結(jié)論：大鼠胰腺大部分切除后，胰腺再生過(guò)程中靜止?fàn)顟B(tài)的胰腺干細(xì)胞激活后增生并分化，而且胰腺干細(xì)胞主要位于導(dǎo)管上皮中。 2.大鼠胰腺次全切除后導(dǎo)管上皮細(xì)胞Pdx-1表達(dá)規(guī)律及意義 目的：研究大

3、鼠胰腺大部分切除術(shù)后，殘余胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞Pdx-1表達(dá)規(guī)律，探討Pdx-1表達(dá)的意義。方法：手術(shù)切除大鼠胰腺約90％組織，不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物后取材，解剖顯微鏡下游離胰腺導(dǎo)管，逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫印跡技術(shù)(Westernblots)檢測(cè)導(dǎo)管上皮細(xì)胞中Pdx-1mRNA與蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組部分胰腺組織直接行免疫組織化學(xué)檢測(cè)Pdx-1蛋白表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組手術(shù)后第2d與第3d導(dǎo)管上皮細(xì)胞Pdx-1蛋白表達(dá)顯著升高，高于對(duì)

4、照組兩倍以上，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，第5d到第7d逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平；免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組建模后第2天開始主胰管、大胰管、小胰管細(xì)胞Pdx-1染色指數(shù)均明顯升高，其中小胰管Pdx-1染色指數(shù)升高持續(xù)到建模后第6天，與對(duì)照組比較有極顯著差異(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)組在各時(shí)間點(diǎn)Pdx-1mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論：殘余胰腺再生過(guò)程中導(dǎo)管上皮細(xì)胞中出現(xiàn)Pdx-1蛋白高表達(dá)，提示靜止?fàn)?/p>

5、態(tài)胰腺干細(xì)胞激活后參與殘余胰腺再生，Pdx-1在胰腺干細(xì)胞向不同類型胰腺細(xì)胞分化過(guò)程中起重要的調(diào)控作用，且其表達(dá)受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。 第二部分:大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞體外分離、定向分化及衍生胰島形態(tài)與功能鑒定 1.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞體外分離與定向分化 目的：分離、純化大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)，促進(jìn)其增殖及誘導(dǎo)向胰島細(xì)胞定向分化，建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分離、純化及定向分化的技術(shù)體系。方法：采用膠原酶逆行灌注法

6、消化，獲得粗制的胰腺細(xì)胞，葡聚糖400(Ficoll400)密度梯度離心純化胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，在體外培養(yǎng)中，利用不同胰腺細(xì)胞的貼壁差異性進(jìn)一步純化胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，以臺(tái)朌藍(lán)染色檢測(cè)分離純化的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞活性，并用角蛋白-19(CK-19)免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒定；RMPI1640+10％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)原代導(dǎo)管上皮細(xì)胞以促進(jìn)其增殖，培養(yǎng)一周后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM/F12并加入角朊細(xì)胞生長(zhǎng)因子等進(jìn)一步促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞增殖，當(dāng)

7、細(xì)胞達(dá)80％匯合時(shí)傳代，加入高糖及尼克酰胺促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞定向分化；衍生胰島進(jìn)行雙硫腙染色。結(jié)果：臺(tái)朌藍(lán)染色顯示分離的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞活力在95％以上，CK-19染色結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證采用上述方法所獲細(xì)胞絕大多數(shù)為胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。在體外培養(yǎng)中胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞24h開始貼壁，14～21d達(dá)80％融合并形成細(xì)胞克隆，培養(yǎng)第28d可見衍生胰島形成，且其被雙硫腙染成猩紅色。結(jié)論：采用密度梯度離心結(jié)合差異貼壁法可獲得純化的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，

8、且其在體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化條件下可生成胰島細(xì)胞。 2.Pdx-1在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)及衍生胰島形態(tài)鑒定與功能測(cè)定 目的：檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Pdx-1在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)，探討Pdx-1表達(dá)的意義，并對(duì)衍生胰島進(jìn)行形態(tài)鑒定與功能測(cè)定。方法：采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(realtimeRT-PCR)、免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Pdx-1、胰島素基因(Ins，Insulin)及上皮細(xì)胞標(biāo)志抗原CK-19在

9、胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)，并在衍生胰島與成熟胰島細(xì)胞中檢測(cè)上述分子以對(duì)衍生胰島進(jìn)行形態(tài)與基因鑒定；衍生胰島功能測(cè)定采用葡萄糖刺激后放射免疫法檢測(cè)胰島素含量。尼克酰胺(nicotinamide)對(duì)衍生胰島的胰島素分泌功能影響采用不同濃度尼克酰胺孵育衍生胰島后，放射免疫法檢測(cè)培養(yǎng)上清中胰島素含量。結(jié)果：Pdx-1與Ins在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞各個(gè)分化階段表達(dá)逐漸增加，而CK-19在分化過(guò)程中表達(dá)逐漸減少。衍生胰島中Pdx-1與Ins熒光染

10、色陽(yáng)性，CK-19染色弱陽(yáng)性；成熟胰島細(xì)胞中Pdx-1與Ins熒光染色陽(yáng)性，而CK-19染色陰性。放射免疫法檢測(cè)表明衍生胰島可釋放胰島素；尼克酰胺可提高衍生胰島對(duì)葡糖糖刺激的反應(yīng)，促進(jìn)胰島素釋放。結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子Pdx-1在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化過(guò)程中起重要調(diào)控作用，在體外培養(yǎng)條件下分化的衍生胰島具備成熟胰島特異表達(dá)的基因且能分泌胰島素。 第三部分:同種異體衍生胰島移植 目的：探討同種異體衍生胰島移植對(duì)大鼠胰腺大部分切除的繼發(fā)

11、性糖尿病模型血糖調(diào)控作用，評(píng)價(jià)體外衍生胰島在模型鼠內(nèi)的胰島素釋放功能。方法：糖尿病模型建立采用大鼠胰腺大部分切除的方法，血糖水平＞11.1mmol/L認(rèn)為模型建立成功；顯微鏡下挑取800個(gè)左右胰島細(xì)胞團(tuán)移植入模型鼠右腎包膜下，并設(shè)立對(duì)照，各時(shí)間點(diǎn)氧化酶法檢測(cè)不同分組靜脈血血糖水平，并記錄不同分組的平均存活時(shí)間；胰島移植后第5、11d進(jìn)行葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素刺激釋放試驗(yàn)，檢測(cè)移植胰島的胰島素釋放功能；移植后第6、15d部分模型鼠取腎臟標(biāo)本行

12、HE染色，對(duì)移植胰島行病理形態(tài)觀察。結(jié)果：大鼠胰腺大部分切除術(shù)后第2d，血糖水平升高至11.1mmol/L，并繼續(xù)維持在此水平以上；衍生胰島移植可明顯降低模型鼠血糖水平，并維持一周時(shí)間，與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)；移植組大鼠平均生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.05)；移植組靜脈血胰島素水平在移植后5d內(nèi)與對(duì)照組相似，至第11d后明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)；HE染色顯示衍生胰島在腎包膜內(nèi)存活，并具有完整的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)。結(jié)論：