烏司他丁通過Akt-mTOR通路保護受氧化應(yīng)激的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞.pdf

1、目的:
　　本實驗擬研究烏司他丁對過氧化氫致人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)氧化應(yīng)激損傷的保護作用。
　　方法:
　　根據(jù)H2O2濃度梯度實驗選取200μmol/L H2O2作為制作HUVEC細胞氧化應(yīng)激模型的實驗濃度;通過烏司他丁保護作用濃度梯度實驗選取50u/ml烏司他丁作為其實驗濃度。制作HUVEC細胞氧化應(yīng)激模型:取對數(shù)期HUVEC細胞按104/孔接種入96孔板中，待細胞貼壁后，分別加入烏司他丁或LY2940

2、02作用2h后，加入終濃度200μmol/L H2O2，作用24h。
　　將HUVEC細胞分為5組，依次為對照組、過氧化氫組、過氧化氫+烏司他丁組、過氧化氫+烏司他丁+LY294002組、過氧化氫+LY294002組，用細胞增殖檢測試劑盒（cck-8法）檢測細胞存活率;用丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒檢測MDA和SOD的產(chǎn)生;用流式細胞術(shù)檢測HUVEC細胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)(ROS)的變化;用流式細胞術(shù)檢測HUVEC

3、細胞凋亡率;用Westernblot法檢測Akt、Erk、mTOR、Caspase3、PARP等蛋白表達的變化。
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、與對照組相比，實驗濃度的烏司他丁明顯提高了HUVEC細胞存活率（34.85±2.67％升至68.77％±4.12％）(P＜0.01)，提高細胞內(nèi)S

4、OD產(chǎn)生（38.81±2.63％升至72.77±3.43％）(P＜0.01)、降低了MDA含量（338.57±15.50％降至138.26±8.37％）(P＜0.01)、減少了ROS生成（153.46±6.23％降至121.57±5.39％）(P＜0.01)，顯著降低受氧化應(yīng)激的HUVEC細胞的凋亡率（18.9±1.37％降至7.89±0.12％）(P＜0.01)，使細胞內(nèi)凋亡蛋白cleaved-caspase3、cleaved-PAR

5、P表達明顯減弱，并且可以有效活化Akt、mTOR等蛋白磷酸化的表達。
　　2、用PI3K/Akt通路阻斷劑LY294002后，烏司他丁的上述抗氧化應(yīng)激作用和對Akt、mTOR等蛋白的活化作用均出現(xiàn)不同程度的減弱和下調(diào)，細胞凋亡也發(fā)生相應(yīng)的增高，凋亡蛋白cleaved-caspase3、cleaved-PARP表達也隨之增高，表現(xiàn)出明顯的抗凋亡的作用。
　　結(jié)論:
　　實驗劑量的烏司他丁可以通過降低受氧化應(yīng)激刺激的HUV