姜類(lèi)萜類(lèi)化合物激活P53信號(hào)通路誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡研究.pdf

1、背景:
　　 子宮內(nèi)膜癌是常見(jiàn)的婦產(chǎn)科惡性腫瘤之一。2011年美國(guó)約有8，010名婦女死于子宮內(nèi)膜癌，有近47，130名患者新診斷為子宮內(nèi)膜癌。在所有子宮內(nèi)膜癌患者中，約70％的患者其子宮內(nèi)膜癌病灶局限于宮體，患者5年生存率高達(dá)85％。美國(guó)婦科腫瘤組單藥或聯(lián)合化療藥物臨床試驗(yàn)（包括鉑類(lèi)，紫杉醇類(lèi)及蒽環(huán)類(lèi)抗生素類(lèi)等），晚期（FIGO分期Ⅲ、Ⅳ期）和復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者中僅有少數(shù)患者表現(xiàn)為對(duì)化療藥物有較好反應(yīng)，患者臨床癥狀、體征，實(shí)

2、驗(yàn)室檢查以及影像學(xué)檢查達(dá)到臨床完全緩解。雖然子宮內(nèi)膜癌患者經(jīng)聯(lián)合化療后緩解率提高，但患者無(wú)病進(jìn)展生存期(PFS)較短，一般為5-7個(gè)月，而且病死率較高。這些臨床數(shù)據(jù)表明目前亟待開(kāi)發(fā)新型有效子宮內(nèi)膜癌化療預(yù)防和治療藥物。
　　 天然食品是眾多化療藥物有效活性成份的重要來(lái)源之一，并對(duì)子宮內(nèi)膜癌和其他類(lèi)型腫瘤起化療預(yù)防和治療作用。已有研究發(fā)現(xiàn)姜干粉或可溶性提取液能夠誘導(dǎo)皮膚癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌以及卵巢癌細(xì)胞系細(xì)胞周期停滯和凋亡

3、。在SENCAR小鼠腫瘤模型中，通過(guò)皮膚局部涂抹姜的乙醇萃取液可以降低DMBA/TPA誘導(dǎo)的皮膚腫瘤的發(fā)病率以及腫瘤大小和數(shù)量。
　　 已有研究顯示，姜干粉和可溶性提取液中起抗癌作用的主要生物活性成份是多聚酚類(lèi)化合物，如4-、6-、8-、10-gingerols，paradol和shogaol。對(duì)不同腫瘤的體外和體內(nèi)研究顯示，多聚酚類(lèi)化合物尤其是gingerols具有有效抗腫瘤細(xì)胞增生和抗腫瘤血管形成的特性。研究顯示，6-gin

4、gerol可以通過(guò)誘導(dǎo)CyclinD蛋白降解及激活β-catenin、PKCdelta和GSK3beta等信號(hào)通路的機(jī)制抑制人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增生，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和G1期細(xì)胞周期停滯。姜有效活性成份shagaol可以通過(guò)抑制NF-κB激活以及降低VEGF和IL-8分泌的機(jī)制顯著抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞系細(xì)胞增生。6-gingerol可以通過(guò)增加凋亡相關(guān)p53蛋白及其下游促凋亡蛋白Bax表達(dá)，同時(shí)降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)等機(jī)制誘導(dǎo)前列腺癌

5、細(xì)胞系LnCap細(xì)胞凋亡。
　　 提取姜有效活性成份的途徑主要有兩種。一種是通過(guò)干燥生姜的方法獲得姜干粉，另一種是通過(guò)加熱生姜的方法獲得姜的可溶性提取液。也有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)蒸汽蒸餾生姜根莖的方法也能夠獲得姜的有效生物活性成分。到目前為止對(duì)姜蒸汽蒸餾提取物抗癌特性的研究甚少。之前研究表明姜干粉和可溶性提取物中起抗癌作用的主要活性成份是多聚酚類(lèi)化合物，而姜蒸氣蒸餾提取物的化學(xué)分析顯示姜蒸餾提取物中多聚酚類(lèi)化合物含量極少。姜蒸汽蒸餾提取

6、物對(duì)有效抗癌成份及其作用機(jī)制有待研究。
　　 研究目的:
　　 本研究旨在探討姜蒸汽蒸餾提取物(SDGE)的化學(xué)組成，有效抗腫瘤化學(xué)成份;姜蒸汽蒸餾提取物(SDGE)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生的影響以及其抗癌作用機(jī)制。
　　 1.方法:
　　 1.1提取姜蒸汽蒸餾產(chǎn)物(SDGE)
　　 從供應(yīng)商處購(gòu)得生姜，用蒸餾水洗凈后將生姜切成0.5厘米大小塊狀。將250-300克姜轉(zhuǎn)移到1000毫升Clevenge

7、r水蒸汽蒸餾裝置的圓底燒瓶中，注入500毫升去離子水(18MOhm-cm)浸沒(méi)姜。持續(xù)加熱圓底燒瓶4-6小時(shí)。從clevenger裝置中分離的油狀混合物比水輕，可通過(guò)定期引流分離管中的液體來(lái)進(jìn)行收集。通過(guò)離心分離得到上層淡黃色提取物(SDGE)后立即分裝在離心管中，-80℃冰箱保存實(shí)驗(yàn)前取出。通過(guò)稱(chēng)量SDGE質(zhì)量和體積計(jì)算出SDGE密度為0.87g/ml，這個(gè)數(shù)值用于換算提取物的濃度，方便之后生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
　　 1.2細(xì)胞

8、增殖實(shí)驗(yàn)（MTT實(shí)驗(yàn)）
　　 1.21四甲基偶氮唑鹽攝取法檢測(cè)SDGE、citral和6-gingerol對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa和ECC-1細(xì)胞增生的影響。
　　 用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞以5000個(gè)/孔的密度接種于96孔板。用不同濃度梯度SDGE(0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml),citral(1.5μM、15μM、150μM)和6-gingero

9、l（1.5μM、15μM、150μM）處理細(xì)胞，細(xì)胞置于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，每孔加入20μl3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，細(xì)胞培養(yǎng)板置于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中再孵育3小時(shí)。3小時(shí)后每孔中加入100μlDMSO溶液溶解甲瓚結(jié)晶。細(xì)胞培養(yǎng)板置于水平搖床上低速震蕩5分鐘。紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)570nm處讀取吸光值OD。
　　 1.22SDGE聯(lián)合銫-13

10、7γ放射線(xiàn)照射或順鉑溶液處理細(xì)胞
　　 四甲基偶氮唑鹽攝取法（MTT實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)SDGE是否能夠加強(qiáng)放射線(xiàn)或化療試劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增生抑制作用。實(shí)驗(yàn)第一天將Ishikawa或ECC-1細(xì)胞以5000個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁后，在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入單純細(xì)胞培養(yǎng)基或2.5μg/mlSDGE溶液，細(xì)胞培養(yǎng)板置于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)第三天，在一部分細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入順鉑溶液（5μM）;另一部

11、分細(xì)胞培養(yǎng)孔用銫-137放射儀進(jìn)行照射，單次照射劑量為4Gy。細(xì)胞培養(yǎng)板置于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。用四甲基偶氮唑鹽攝取法檢測(cè)不同處理?xiàng)l件對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生的影響，實(shí)驗(yàn)步驟如上。
　　 1.3氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)分析SDGE化學(xué)組成
　　 用GC-17A氣相色譜儀及QP-5000四極質(zhì)譜分析儀(Shimadzu公司)分析SDGE化學(xué)組成。分析前將20μl新鮮解凍的SDGE樣品加入到1

12、000μl戊烷中進(jìn)行稀釋。吸取1μl稀釋后的SDGE樣品注入氣相色譜儀。設(shè)置GC-MS參數(shù)，分流比:1∶50;氦氣流速:1.4ml/min。設(shè)置GC-MS內(nèi)非極性RTX-5MS柱（長(zhǎng)30米，內(nèi)徑0.25毫米，膜厚0.25微米）柱起始溫度為70℃，以4℃/min速度加熱至180℃后維持。設(shè)置GC-MS電離檢測(cè)方式為全掃描，陽(yáng)離子模式質(zhì)荷比(m/z)范圍:41-300。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)搜索美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（NIST圖書(shū)館）將獲得的數(shù)據(jù)與

13、Adams算術(shù)保留指數(shù)值進(jìn)行對(duì)比進(jìn)而鑒別SDGE的化合物組成。
　　 1.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
　　 用FITC-AnnexinV流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法（BD公司凋亡檢測(cè)試劑盒）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。方法如下:在2×106個(gè)細(xì)胞中加入0.25μg/mlSDGE和或100μMPifithrin-α，細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0-16小時(shí)。用胰酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞后用冷PBS緩沖液沖洗2遍，用1×結(jié)合緩沖液(10mMHEP

14、ES/NaOH，pH7.4，140mMNaCl，2.5mMCaCl2)重懸制成1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液。將100μl細(xì)胞懸液（1×105個(gè)細(xì)胞）轉(zhuǎn)移至5ml流式管中，加入5μlFITC-AnnexinV和5μlpropidiumiodide(PI)進(jìn)行染色，輕輕渦旋震蕩后，室溫避光孵育15分鐘。1×結(jié)合緩沖液洗細(xì)胞一次，用500μl1×結(jié)合緩沖液重懸。將細(xì)胞置于冰上避光，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果用F

15、lowJo軟件進(jìn)行分析。
　　 1.5細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)
　　 用不同濃度SDGE（250ng/ml或2.5μg/ml）處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞24、48和72小時(shí)后，胰酶消化收集細(xì)胞。PBS緩沖液洗后重懸，渦旋震蕩同時(shí)逐滴加入75％乙醇進(jìn)行固定。PBS緩沖液洗細(xì)胞后加入propidiumiodide(PI)進(jìn)行染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期狀態(tài)，步驟如上，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果用FlowJo軟件進(jìn)行分析。
　　 1.6蛋白質(zhì)印跡實(shí)

16、驗(yàn)
　　 用250ng/mlSDGE處理細(xì)胞特定時(shí)間后收集細(xì)胞，冷PBS緩沖液沖洗，離心去掉上清，往細(xì)胞沉淀中加入RIPA緩沖液（Pierce公司）進(jìn)行細(xì)胞裂解，裂解液中加入蛋白酶抑制劑cocktail（Thermo公司）。超聲裂解細(xì)胞后離心收集上清，BCA實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取25μg蛋白質(zhì)樣品加入聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中。7.5或12％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后將分離蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜用含5％

17、脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉一小時(shí)，特異性一抗孵育過(guò)夜。第二天用TBST緩沖液洗膜3次后，過(guò)氧化物酶結(jié)合二抗孵育1小時(shí)。TBST緩沖液洗膜3次后用WestDura或WestFemto化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo公司）進(jìn)行顯色。應(yīng)用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。
　　 1.7線(xiàn)粒體膜電位分析
　　 將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞接種在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.02

18、5μg/ml或0.25μg/mlSDGE;對(duì)照組加入等量DMSO。細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。用PBS緩沖液洗細(xì)胞后胰酶消化收集細(xì)胞，制成1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液。將100μl細(xì)胞懸液（1×106個(gè)細(xì)胞）轉(zhuǎn)移至5ml流式管中，加入40nMDiOC637℃孵育30分鐘。洗細(xì)胞后用含2％FBSPBS緩沖液400μl重懸。FACSCALIBUR流式細(xì)胞儀檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

19、
　　 1.8鈣離子內(nèi)流實(shí)驗(yàn)分析
　　 胰酶消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞。用PBS緩沖液洗滌3次后，用含0.5％BSA培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞密度為1×107/ml。向1×107/ml細(xì)胞懸液中加入2mMIndo1-AM和4mMprobenecid，置于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。用PBS緩沖液洗滌3次，用含1mMCaCl2的0.5％BSADPBS緩沖液重懸，使細(xì)胞密度為2×106/ml。用

20、35微米濾器過(guò)濾細(xì)胞，并保持細(xì)胞在37℃。流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析時(shí)，初始3分鐘檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度，然后各試管中分別加入0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/mlSDGE或1μMIonomycin繼續(xù)上機(jī)檢測(cè)7分鐘，觀察記錄鈣離子流量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用FlowJo軟件進(jìn)行分析。
　　 1.9統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用單樣本T檢驗(yàn)，P≤0.05被認(rèn)為有顯著性差異。數(shù)據(jù)分析用GraphPadPrizm軟件。
　

21、　 2結(jié)果
　　 2.1蒸汽蒸餾實(shí)驗(yàn)從姜中提取姜蒸汽蒸餾產(chǎn)物(SDGE)
　　 通過(guò)改良Clevenger水蒸汽蒸餾裝置我們可以方便地從姜中提取出SDGE，從250克姜中可以提取出大約300毫克精油。我們先后用五批姜提取SDGE。其中兩批是從印度不巴內(nèi)什瓦爾購(gòu)買(mǎi)，在當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室通過(guò)蒸汽蒸餾方法提取SDGE。其余三批是從美國(guó)威斯康辛州購(gòu)買(mǎi)，在威斯康辛大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取SDGE。這五批姜提取的SDGE產(chǎn)量大致相同，通過(guò)計(jì)算SDG

22、E密度約為0.8g/L。
　　 2.2姜蒸汽蒸餾提取物(SDGE)是有效的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生抑制劑
　　 首先檢測(cè)SDGE對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系ECC-1和Ishikawa細(xì)胞增生的影響。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SDGE低濃度250ng/ml時(shí)兩種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生即受抑制（圖1A、B）;SDGE高濃度2.5μg/ml時(shí)，兩種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生顯著受到抑制(P＜0.05)。圖1A、B中實(shí)驗(yàn)結(jié)果是3次獨(dú)立MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的累計(jì)，實(shí)驗(yàn)用S

23、DGE來(lái)自3個(gè)不同產(chǎn)地。在實(shí)驗(yàn)中SDGE每個(gè)濃度設(shè)有16個(gè)復(fù)孔。因此圖1中每點(diǎn)是48個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)的平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅有微小的差異，可重復(fù)性高，能清楚地說(shuō)明SDGE對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系ECC-1和Ishikawa細(xì)胞增生的影響。MTT實(shí)驗(yàn)顯示72小時(shí)，SDGE對(duì)兩種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50約為1.25μg/ml。
　　 2.3SDGE聯(lián)合銫-137γ放射線(xiàn)照射或順鉑試劑加強(qiáng)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增生抑制作用
　　 晚期（FIGO

24、分期Ⅲ、Ⅳ期）和復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的處理原則是放療和化療。因此我們進(jìn)一步分析SDGE聯(lián)合銫-137γ放射線(xiàn)照射或順鉑試劑是否能夠加強(qiáng)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增生抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:SDGE對(duì)兩種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的增生抑制率為40％;SDGE對(duì)ECC-1細(xì)胞增生抑制率與銫-137γ放射線(xiàn)照射對(duì)兩種細(xì)胞的增生抑制率相同（圖1C、D）;而Ishikawa細(xì)胞，SDGE對(duì)Ishikawa細(xì)胞的增生抑制率比銫-137γ放射線(xiàn)照射對(duì)Ishikaw

25、a細(xì)胞的增生抑制率高10％（圖1C），SDGE比銫-137γ放射線(xiàn)照射更有效抑制Ishikawa細(xì)胞增生;對(duì)兩種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系ECC-1和Ishikawa細(xì)胞，SDGE聯(lián)合銫-137γ放射線(xiàn)照射對(duì)細(xì)胞增生抑制率比單獨(dú)銫-137γ放射線(xiàn)照射對(duì)細(xì)胞的增生抑制率高23-25％（圖1C、D），說(shuō)明SDGE加強(qiáng)銫-137γ放射線(xiàn)照射對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增生抑制作用。
　　 我們進(jìn)一步分析了SDGE聯(lián)合順鉑試劑對(duì)Ishikawa和ECC1細(xì)

26、胞增生的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Ishikawa細(xì)胞，72小時(shí)SDGE聯(lián)合順鉑試劑對(duì)細(xì)胞的增生抑制率比單獨(dú)順鉑處理對(duì)細(xì)胞增生抑制率高26％（圖1E）;而ECC-1細(xì)胞，SDGE聯(lián)合順鉑試劑與順鉑單獨(dú)對(duì)細(xì)胞的增生抑制率相同（圖1F）。
　　 通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)我們還比較了SDGE與順鉑的細(xì)胞毒性。與對(duì)照組相比，順鉑（5μM;1.5μg/ml）對(duì)Ishikawa細(xì)胞和ECC-1細(xì)胞的增生抑制率分別為59％和61％（圖1E、F）。而SD

27、GE（2.5μg/ml）對(duì)Ishikawa和ECC-1細(xì)胞的增生抑制率分別為37％和42％（圖1E、F）。這些數(shù)據(jù)提示，SDGE與順鉑有相同有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生的作用，為進(jìn)一步研究SDGE抗癌機(jī)制提供有力的依據(jù)。
　　 2.4SDGE誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡
　　 MTT實(shí)驗(yàn)顯示SDGE是一種有效的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生抑制劑。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生降低是SDGE直接誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的結(jié)果。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

28、顯示，用低濃度SDGE(250ng/mL)處理細(xì)胞后，細(xì)胞表面AnnexinV和PI染色增加（圖2A）。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入SDGE后，最早在30分鐘即能觀察到FITC-AnnexinV染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加（圖2A）。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用SDGE(250ng/ml)處理ECC-1（數(shù)據(jù)未顯示）和Ishikawa細(xì)胞24，48和72小時(shí)后，裂解caspase-3蛋白表達(dá)增加（圖2B）。我們進(jìn)一步檢測(cè)SDGE對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期狀態(tài)的影響。用S

29、DGE（250ng/ml或2.5μg/ml）處理Ishikawa細(xì)胞24，48和72小時(shí)后，細(xì)胞用PI進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期狀態(tài)改變（圖2C）。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析顯示，SDGE對(duì)細(xì)胞周期狀態(tài)沒(méi)有造成顯著的影響，僅觀察到細(xì)胞周期中S期細(xì)胞比例輕微降低。而且僅在高濃度SDGE2.5μg/ml處理Ishikawa細(xì)胞時(shí)觀察到。而低濃度250ng/mlSDGE處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞周期狀態(tài)沒(méi)有任何改變，即便這個(gè)濃度已經(jīng)能誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡

30、。
　　 2.5SDGE的化學(xué)組成
　　 SDGE誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的特性促使我們進(jìn)一步研究SDGE的化學(xué)組成以及其中起抗癌作用的有效生物活性成份。我們用氣象色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)對(duì)三批不同產(chǎn)地SDGE進(jìn)行分析。戊烷稀釋SDGE后，揮發(fā)成分在通過(guò)非極性RTX-5MS色譜柱時(shí)得到分離（圖3），色譜流出曲線(xiàn)上的各個(gè)峰所代表的成分通過(guò)電子離子質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。通過(guò)分析色譜流出曲線(xiàn)上每個(gè)峰的滯留時(shí)間，峰面積或峰高值，可以

31、鑒定SDGE的化學(xué)組成及各成份所占比例。我們總共從SDGE中鑒別出22種化合物及其相對(duì)含量（表1）。數(shù)據(jù)分析顯示從不同產(chǎn)地姜提取的SDGE化學(xué)組成基本一致。
　　 氣象色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析結(jié)果顯示，SDGE中不含多聚酚類(lèi)化合物，如gingerol，shogaol和paradol等。而在之前的研究中已經(jīng)報(bào)道，姜干粉和可溶性提取液中的有效抗癌活性成份正是這些多聚酚類(lèi)化合物[20，24，25，36]。因此我們用純化的6-gingerol

32、進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生的影響。MTT實(shí)驗(yàn)顯示即便在高濃度150μM時(shí)，6-gingerol仍不能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生（圖4A和4B）。6-gingerol的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持我們的GC-MS分析。
　　 氣象色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，SDGE的主要組成成份是類(lèi)萜類(lèi)化合物。而citral，是Neral和geranial兩種類(lèi)萜異構(gòu)體的混合物，占到SDGE化合物組成的35-45％（表1）。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，

33、citral能顯著降低Ishikawa和ECC-1細(xì)胞增生。Citral對(duì)兩種細(xì)胞的半數(shù)抑制摩爾濃度IC50約為15-25μM(圖4C和4D)。Citral的半數(shù)抑制濃度IC50約為2.28-3.8μg/ml。而SDGE有效的IC50為1.25μg/ml，因neral和geranial僅占SDGE組成的35-45％，因此SDGE的IC50相當(dāng)于citral2.8-3.7μM。這個(gè)濃度要顯著低于MTT實(shí)驗(yàn)得出的citral半數(shù)抑制濃度15

34、-25μM（圖4C和4D）。因此我們得出以下結(jié)論，在SDGE中除外citral，還有其他的類(lèi)萜類(lèi)化合物也貢獻(xiàn)了顯著的抗癌作用。在接下來(lái)的研究中，我們?nèi)园裇DGE而非citral作為機(jī)制研究的主要對(duì)象。
　　 2.6SDGE誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量增加，線(xiàn)粒體膜電位下降
　　 用SDGE(0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml)處理Ishikawa細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量顯著增加(圖5A)。在Ishikaw

35、a細(xì)胞中加入SDGE初始3分鐘后即可以觀察到細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量增加。鈣離子通量的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)形態(tài)與ionomycin（1μM）的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)形態(tài)相似。細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量與SDGE濃度成正比。實(shí)驗(yàn)顯示SDGE(2.5μg/ml)誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量峰值是ionomycin（1μM）鈣流量峰值的60-70％。在細(xì)胞中加入Ionomycin后細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量急劇增加，在一分鐘內(nèi)迅速降低。而SDGE(0.025μg/ml、0.25μg/ml、

36、2.5μg/ml)誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量增加以及下降相對(duì)緩慢(圖5A)。細(xì)胞中加入SDGE之后5-6分鐘細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量下降但仍高于初始3分鐘基線(xiàn)鈣離子水平(圖5A)。
　　 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa培養(yǎng)基中加入SDGE后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量增加，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)增加，說(shuō)明線(xiàn)粒體功能發(fā)生缺陷。我們進(jìn)一步用流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位改變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用SDGE（25ng/ml或250ng/ml）處理Ishikawa細(xì)胞后，細(xì)胞

37、線(xiàn)粒體膜電位降低兩倍（圖5B）。
　　 2.7SDGE誘導(dǎo)Bax/Bcl-2比值增加
　　 Bcl-2是一種線(xiàn)粒體外膜相關(guān)抗凋亡蛋白。實(shí)驗(yàn)顯示SDGE處理Ishikawa細(xì)胞后，細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降。促使我們進(jìn)一步研究SDGE對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。我們用SDGE(250ng/ml)處理子Ishikawa細(xì)胞特定時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示24，48和72小時(shí)后Ishikawa細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而促凋亡

38、Bax蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯改變，Bax/Bcl-2比值增加1.3-2.0倍(圖6A)，ECC-1數(shù)據(jù)未顯示。
　　 2.8SDGE激活p53信號(hào)通路
　　 p53腫瘤抑癌基因是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細(xì)胞死亡和各種細(xì)胞程序中起關(guān)鍵作用。p53參與調(diào)控的細(xì)胞事件包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)以及衰老等。實(shí)驗(yàn)顯示SDGE能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，因此我們進(jìn)一步研究SDGE對(duì)p53蛋白的影響。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)顯示，SDGE(2

39、50ng/ml)處理Ishikawa細(xì)胞后，p53蛋白15位絲氨酸磷酸化迅速增加(圖6B)，說(shuō)明p53被激活。
　　 pifithrin-α是一種特異性p53蛋白抑制劑[37]。用pifithrin-α預(yù)處理Ishikawa細(xì)胞后，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示SDGE(250ng/ml)誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡完全被抑制（圖6C）。對(duì)照組中細(xì)胞FITC-AnnexinV染色陽(yáng)性率約為11％（細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入SDGE或pifithrin-α

40、）;SDGE處理組細(xì)胞FITC-AnnexinV染色陽(yáng)性率約為39.5％;pifithrin-α預(yù)處理組細(xì)胞FITC-AnnexinV染色陽(yáng)性率約為10％。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，SDGE誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡是通過(guò)激活p53信號(hào)通路。
　　 2.9SDGE不能誘導(dǎo)p53negSKOV3細(xì)胞凋亡
　　 有研究報(bào)道卵巢癌SKOV-3細(xì)胞系不表達(dá)p53蛋白。因此我們采用SKOV3細(xì)胞研究在無(wú)p53蛋白存在情況下，SDGE對(duì)細(xì)

41、胞凋亡的影響。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，用SDGE(250ng/ml)處理SKOV-3細(xì)胞30分鐘，2、4和16小時(shí)后，細(xì)胞表面FITC-AnnexinV染色率沒(méi)有改變，SKOV3細(xì)胞無(wú)凋亡發(fā)生（圖6D）。我們進(jìn)一步用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)SDGE處理SKOV-3細(xì)胞未發(fā)生凋亡，實(shí)驗(yàn)顯示SDGE處理后細(xì)胞無(wú)裂解caspase3蛋白表達(dá)（圖6E）。
　　 3.結(jié)論:
　　 (1)SDGE主要組成成份是22種類(lèi)萜類(lèi)化合物。SDGE可通過(guò)