體外兔胚成纖維飼細(xì)胞克隆兔角膜緣干細(xì)胞及自體移植的實驗研究.pdf

1、安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文體外兔胚成纖維飼細(xì)胞克隆兔角膜緣干細(xì)胞及自體移植的實驗研究姓名：蔣自培申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：朱美玲;王明麗20040501窒堂墮登叁堂堡圭蘭堡壘壅 一——體外兔胚成纖維飼細(xì)胞克隆兔角膜緣干細(xì)胞及自體移植的實驗研究摘要本研究以無增殖能力的兔胚成纖維細(xì)胞為飼細(xì)胞，研究兔角膜緣干細(xì)胞在體外的增殖能力及其生物學(xué)鑒定；并以羊膜為載體將培養(yǎng)的自體角膜緣干細(xì)胞移植到角膜緣干細(xì)胞嚴(yán)重缺損的兔眼角膜上，并觀察其效

2、果。為干細(xì)胞移植這一具有發(fā)展前景的臨床治療方法提供實驗依據(jù)。本研究分為兩部分。一體外兔胚成纖維飼細(xì)胞克隆兔角膜緣干細(xì)胞的實驗研究目的 了解經(jīng)絲裂霉素C 處理不同時間后的兔胚成纖維細(xì)胞的增殖能力，確定兔胚成纖維細(xì)胞為飼細(xì)胞的條件；了解兔角膜緣干細(xì)胞在經(jīng)絲裂霉素c 處理后的兔胚成纖維細(xì)胞作為飼細(xì)胞的培養(yǎng)條件下，干細(xì)胞克隆團(tuán)的增殖情況，并探討飼細(xì)胞的作用：對兔胚成纖維飼細(xì)胞層上形成克隆的兔角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生物學(xué)活性鑒定。方法采用常規(guī)方

3、法培養(yǎng)兔胚成纖維細(xì)胞，同時用1 0 №／m 1 絲裂霉素C 處理不同時間后，觀察不同條件下細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及數(shù)量；將兔角膜緣干細(xì)胞消化下來，分別接種于經(jīng)絲裂霉素C 處理后的兔胚成纖維細(xì)胞，觀察各組干細(xì)胞克隆形成率( C F E ) ，同時對比有飼細(xì)胞層的兔角膜緣干細(xì)胞和無飼細(xì)胞層的兔角膜緣干細(xì)胞克隆形成率( C F E ) 在原代培養(yǎng)和傳一、二、三代培養(yǎng)中各組的差別；觀察兔角膜緣干細(xì)胞克隆團(tuán)光鏡特征、電鏡超微結(jié)構(gòu)，間接免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察

4、A E l 、f i E 5 、P C N A 單克隆抗體免疫反應(yīng)等對克隆的干細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生物學(xué)活性鑒定。結(jié)果兔胚成纖維細(xì)胞能長期傳代，細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形，易于分辨。而經(jīng)l O n g ／m 1 絲裂霉素c 處理2 ．5 h 的兔胚成纖維細(xì)胞，形態(tài)雖然仍均一，呈梭形，但培養(yǎng)期間細(xì)胞數(shù)量沒有變化；接種于經(jīng)絲裂霉素c 處理的兔胚成纖維的兔角膜緣干細(xì)胞3 ～4 天后開始形成單個克隆，克隆團(tuán)中細(xì)胞數(shù)為4 個以上，5 ～6 天克隆團(tuán)中細(xì)胞數(shù)