體外兔胚成纖維飼細胞克隆兔角膜緣干細胞及自體移植的實驗研究.pdf

1、安徽醫(yī)科大學碩士學位論文體外兔胚成纖維飼細胞克隆兔角膜緣干細胞及自體移植的實驗研究姓名：蔣自培申請學位級別：碩士專業(yè)：眼科學指導教師：朱美玲;王明麗20040501窒堂墮登叁堂堡圭蘭堡壘壅 一——體外兔胚成纖維飼細胞克隆兔角膜緣干細胞及自體移植的實驗研究摘要本研究以無增殖能力的兔胚成纖維細胞為飼細胞，研究兔角膜緣干細胞在體外的增殖能力及其生物學鑒定；并以羊膜為載體將培養(yǎng)的自體角膜緣干細胞移植到角膜緣干細胞嚴重缺損的兔眼角膜上，并觀察其效

2、果。為干細胞移植這一具有發(fā)展前景的臨床治療方法提供實驗依據(jù)。本研究分為兩部分。一體外兔胚成纖維飼細胞克隆兔角膜緣干細胞的實驗研究目的 了解經(jīng)絲裂霉素C 處理不同時間后的兔胚成纖維細胞的增殖能力，確定兔胚成纖維細胞為飼細胞的條件；了解兔角膜緣干細胞在經(jīng)絲裂霉素c 處理后的兔胚成纖維細胞作為飼細胞的培養(yǎng)條件下，干細胞克隆團的增殖情況，并探討飼細胞的作用：對兔胚成纖維飼細胞層上形成克隆的兔角膜緣干細胞進行形態(tài)學和生物學活性鑒定。方法采用常規(guī)方

3、法培養(yǎng)兔胚成纖維細胞，同時用1 0 №／m 1 絲裂霉素C 處理不同時間后，觀察不同條件下細胞形態(tài)學特征及數(shù)量；將兔角膜緣干細胞消化下來，分別接種于經(jīng)絲裂霉素C 處理后的兔胚成纖維細胞，觀察各組干細胞克隆形成率( C F E ) ，同時對比有飼細胞層的兔角膜緣干細胞和無飼細胞層的兔角膜緣干細胞克隆形成率( C F E ) 在原代培養(yǎng)和傳一、二、三代培養(yǎng)中各組的差別；觀察兔角膜緣干細胞克隆團光鏡特征、電鏡超微結(jié)構(gòu)，間接免疫細胞化學染色觀察

4、A E l 、f i E 5 、P C N A 單克隆抗體免疫反應等對克隆的干細胞進行形態(tài)學和生物學活性鑒定。結(jié)果兔胚成纖維細胞能長期傳代，細胞形態(tài)均一，呈梭形，易于分辨。而經(jīng)l O n g ／m 1 絲裂霉素c 處理2 ．5 h 的兔胚成纖維細胞，形態(tài)雖然仍均一，呈梭形，但培養(yǎng)期間細胞數(shù)量沒有變化；接種于經(jīng)絲裂霉素c 處理的兔胚成纖維的兔角膜緣干細胞3 ～4 天后開始形成單個克隆，克隆團中細胞數(shù)為4 個以上，5 ～6 天克隆團中細胞數(shù)