ECRG4在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其在鼻咽癌惡性生物學(xué)行為中作用與機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　在本研究中，我們分別應(yīng)用RT-PCR以及Western-blot方法識(shí)別ECRG4在鼻咽癌組織以及細(xì)胞系等方面的mRNA與蛋白表達(dá)狀態(tài);通過免疫組化研究ECRG4在鼻咽癌方面的表達(dá)狀態(tài)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)要素，同時(shí)明確和臨床病理的具體聯(lián)系;建立ECRG4過表達(dá)脂質(zhì)體，使用transwell以及裸鼠尾實(shí)驗(yàn)來(lái)明確ECRG4對(duì)細(xì)胞系5-8F、CNE2相關(guān)侵襲以及轉(zhuǎn)移所構(gòu)成的基礎(chǔ)影響;Western blot研究ECRG4對(duì)于轉(zhuǎn)移表達(dá)存

2、在的基礎(chǔ)影響;進(jìn)一步使用RT-PCR以及明膠酶譜法來(lái)研究MMP2的mRNA表達(dá)以及酶活性;調(diào)整MMP2的表達(dá)，transwell觀察MMP2對(duì)于ECRG4控制侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)影響;Western blot研究NF-kB p65的磷酸化狀態(tài);進(jìn)行增殖以及克隆等實(shí)驗(yàn)，同時(shí)明確裸鼠身體中的成瘤實(shí)驗(yàn)ECRG4對(duì)于增殖能力所構(gòu)成的基礎(chǔ)影響;使用流式細(xì)胞儀的方案研究ECRG4對(duì)細(xì)胞周期所存在的影響;Western blot研究ECRG4對(duì)于配套調(diào)控蛋

3、白所產(chǎn)生的基礎(chǔ)影響。
　　課題包含以下三個(gè)部分:第一部分:ECRG4在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及意義;第二部分:ECRG4通過NF-kB下調(diào)MMP2的表達(dá)抑制鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移;第三部分: ECRG4抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖
　　第一部分 ECRG4在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及意義
　　1.培養(yǎng)3個(gè)人鼻咽癌細(xì)胞系(5-8F、6-10B、CNE2)和1個(gè)永生化鼻咽上皮細(xì)胞系(NP69)。
　　2.收集河南省人民醫(yī)院及鄭

4、大一附院2006年至2012年切除的鼻咽癌組織及正常鼻咽組織石蠟標(biāo)本。
　　3.采用免疫組化的方法檢測(cè)鼻咽癌組織及正常鼻咽組織的ECRG4的表達(dá)。
　　4.收集2例活檢的鼻咽癌新鮮組織及7例正常鼻咽組織。
　　結(jié)果:
　　1、ECRG4在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織
　　針對(duì)2例活檢癌變組織和7例健康組織進(jìn)行對(duì)比分析，研究其中的蛋白以及mRNA水平的ECRG4表達(dá)狀態(tài)，最終得出不管是在mRNA或蛋白水

5、平中，ECRG4于鼻咽癌組織方面的表達(dá)都明顯低于正常的組織。
　　2、ECRG4在鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　Western-Blot以及RT-PCR分析得出，ECRG4實(shí)際檢測(cè)的3種癌變細(xì)胞6-10B、CNE2中都存在一定的表達(dá)，實(shí)際的表達(dá)量都低于永生化的上皮細(xì)胞系，同時(shí)得出存在高轉(zhuǎn)移特征的5-8F細(xì)胞系，在實(shí)際的表達(dá)水平方面顯著低于不轉(zhuǎn)移性以及低轉(zhuǎn)移性的CNE2細(xì)胞系。
　　3、ECRG4在鼻咽癌組織中表達(dá)的臨床病理

6、學(xué)意義
　　為有效分析ECRG4于鼻咽癌、正常組織之中存在的表達(dá)差異，筆者在分析環(huán)節(jié)中擴(kuò)充樣本規(guī)模，整理153例鼻咽癌以及30例非癌石蠟組織開展配套的檢查工作，最終得出ECRG4于鼻咽癌方面集中于胞漿，較少的存在于胞核的位置。深入分析可得出ECRG4于非癌組織的高表達(dá)數(shù)量為28例(93.3％)，低表達(dá)的數(shù)量為2例(6.7％)，而對(duì)于鼻咽癌方面而言，構(gòu)成高表達(dá)的數(shù)量為81例(52.9％)，構(gòu)成低表達(dá)的數(shù)量為72例(47.1％)，兩類

7、組織的表達(dá)狀況存在顯著的區(qū)別，同時(shí)其中的區(qū)別存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　4、ECRG4在鼻咽癌組織中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義
　　深入探討ECRG4于鼻咽癌方面的實(shí)際表達(dá)狀況和臨床病理學(xué)特征的基礎(chǔ)聯(lián)系時(shí)得出，ECRG4的實(shí)際表達(dá)狀態(tài)和病忠實(shí)際的性別、年齡以及抽煙等并不存在顯著的聯(lián)系。而ECRG4表達(dá)強(qiáng)度和EB、浸潤(rùn)、分化、TNM分期和轉(zhuǎn)移等存在密切的聯(lián)系。即存在EB病毒感染問題的病患，在ECRG4陽(yáng)性表達(dá)率方面

8、低于無(wú)EB感染的群體;而伴隨實(shí)際腫瘤分化度提升的同時(shí)，ECRG4表達(dá)率會(huì)相對(duì)更高;而在腫瘤分期較晚的情況下，ECRG4表達(dá)率則會(huì)相對(duì)更低;存在遠(yuǎn)處及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的實(shí)際陽(yáng)性率顯著低于不存在轉(zhuǎn)移問題的群體，而兩個(gè)組別的數(shù)據(jù)差異存在一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值，p＜0.01。Kaplan-Meier生存期研究得出ECRG4實(shí)際的表達(dá)狀況和病患的預(yù)后存在緊密的聯(lián)系，ECRG4低表達(dá)的病患，在各種生存期參數(shù)上都顯著低于ECRG4高表達(dá)的群體。
　　第二部

9、分:ECRG4通過NF-kB下調(diào)MMP2的表達(dá)抑制鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移
　　方法:
　　1、ECRG4-pcDNA3.1載體的構(gòu)建。
　　2、構(gòu)建ECRG4、MMP2過表達(dá)載體。
　　3、構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體的鼻咽癌細(xì)胞系。
　　4、Transwell小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定5-8F、CNE2細(xì)胞和相關(guān)對(duì)照細(xì)胞具體的遷移與侵襲表現(xiàn)。
　　結(jié)果:
　　1、將p3.1/ECRG4-pcDNA3.11、

10、p3.1/ECRG4-pcDNA3.12和p3.1空載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌5-8F以及CNE2細(xì)胞系，通過G418而開展配套的陽(yáng)性克隆篩選工作，進(jìn)一步得到可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效果的對(duì)應(yīng)6株細(xì)胞系，將其名稱依次界定為5-8F/pcDNA3.11、5-8F/pcDNA3.12、5-8F/control、CNE2/ pcDNA3.11、CNE2/pcDNA3.12以及CNE2/ control。成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體的鼻咽癌細(xì)胞系。

11、　　2、上調(diào)ECRG4的表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力
　　與轉(zhuǎn)染p3.1空載體細(xì)胞相比，ECRG4-pcDNA3.11、ECRG4-pcDNA3.12轉(zhuǎn)染造成5-8F細(xì)胞方面的遷移細(xì)胞數(shù)依次降低78.3％與65.1％，而關(guān)于其中的侵襲細(xì)胞實(shí)際的降低比例則屬于70.4％以及59.8％。進(jìn)而令CNE2細(xì)胞實(shí)際的遷移細(xì)胞數(shù)降低82.5％以及52.7％，而侵襲細(xì)胞數(shù)的減少幅度屬于76.9％以及69.4％。體外遷移以及相關(guān)的侵襲實(shí)驗(yàn)得

12、出，上調(diào)細(xì)胞中的ECRG4表達(dá)可以有效的抑制鼻咽癌細(xì)胞所存在的基礎(chǔ)遷移以及侵襲效應(yīng)，代表著ECRG4或許具備抑制癌細(xì)胞侵襲效應(yīng)的對(duì)應(yīng)能力。
　　3、ECRG4影響鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)
　　為有效的論述ECRG4怎樣控制鼻咽癌細(xì)胞方面存在的遷移以及侵襲效應(yīng)。在分析中采用Western blot來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，探尋ECRG4潛在的相關(guān)靶基因。而在大量的和腫瘤轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系的基因中，實(shí)際選定了曾報(bào)道為屬于ECRG4基礎(chǔ)

13、裂解底物的MMP2、MMP9、Snail、P-catenin和VimentinE-cadherin，、N-cadherin，最終得出上調(diào)ECRG4的表達(dá)，能夠控制鼻咽癌MMP2、Snail以及Vimentin的表達(dá)，體會(huì)E-cadherin的對(duì)應(yīng)表達(dá)，同時(shí)MMP9、N-cadherin以及P-catenin在表達(dá)水平上并不存在顯著的變化。
　　4、上調(diào)ECRG4的表達(dá)降低鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)MMP2的表達(dá)水平及其酶活性
　　細(xì)胞外基

14、質(zhì)降解作為相關(guān)的腫瘤細(xì)胞對(duì)于周邊存在浸潤(rùn)，以及對(duì)于遠(yuǎn)處存在侵襲、轉(zhuǎn)移等變化的必要基礎(chǔ)，當(dāng)前眾多的分析得出基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs和轉(zhuǎn)移之間存在極為緊密的聯(lián)系，例如MMP2于多類腫瘤轉(zhuǎn)移之中起到一定的重要影響，尤其是MMP2也加入到鼻咽癌轉(zhuǎn)移效應(yīng)中。最新的分析得出ECRG4可下調(diào)MMP2的表達(dá)，進(jìn)而抑制相關(guān)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌所存在的轉(zhuǎn)移變化。所以綜合前文中Western blot的對(duì)應(yīng)結(jié)果，推測(cè)ECRG4影響轉(zhuǎn)移或許涉及MMP2的調(diào)節(jié)效應(yīng)。針對(duì)

15、該問題，使用RT-PCR在5-8F、CNE2兩個(gè)細(xì)胞系方面再度驗(yàn)證上調(diào)ECRG4表達(dá)可導(dǎo)致MMP2表達(dá)的下降。進(jìn)而依靠配套的明膠酶譜法而識(shí)別MMP2的酶活性狀態(tài)。最終得出于5-8F、CNE2兩個(gè)細(xì)胞系之中進(jìn)行上調(diào)ECRG4的活動(dòng)，都會(huì)導(dǎo)致MMP2酶活性的顯著下降。
　　第三部分 ECRG4抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖
　　方法:
　　1、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定（CCK8實(shí)驗(yàn)）。
　　2、細(xì)胞平板集落形成實(shí)驗(yàn)
　　3、流

16、式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期
　　4、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)
　　結(jié)果:
　　1、上調(diào)ECRG4抑制細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白PCNA的表達(dá)
　　2、上調(diào)ECRG4的表達(dá)顯著降低鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖能力
　　3、上調(diào)ECRG4的表達(dá)顯著地抑制鼻咽癌細(xì)胞克隆形成能力
　　4、上調(diào)ECRG4表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力
　　結(jié)論:
　　1、發(fā)現(xiàn)ECRG4在鼻咽癌組織的表達(dá)明顯低于正常鼻咽組織;發(fā)現(xiàn)ECRG4在鼻咽癌

17、組織中的表達(dá)水平與EB病毒的感染、組織的分化程度、TNM分期、腫瘤的體積和轉(zhuǎn)移相關(guān);
　　2、發(fā)現(xiàn)上調(diào)ECRG4的表達(dá)可以明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖和成瘤能力;
　　3、ECRG4抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲，可能是通過依賴NF-kB信號(hào)通路下調(diào)MMP2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn);
　　4、上調(diào)ECRG4的表達(dá)可以阻止鼻咽癌細(xì)胞由G1期向S期進(jìn)展，使細(xì)胞停滯于G0/1期，其潛在的機(jī)制可能是部分通過下調(diào)Cyclin D1、Cyc