人鼻咽癌惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的分析與克隆.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文人鼻咽癌惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的分析與克隆姓名：靳玉蘭申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：朱立平20030601生里墜墊墮至!查莖墮堂魚堡苧EST)標(biāo)記成探針后，與As和w細胞的總RNA進行Northern雜交，結(jié)果顯示有4條呈陽性信號，與DDRT—PCR的結(jié)果一致。其中2條為代表已知基因的EST(EST一1，EST一20)，另2條為可拼接的EST(EST一30和EST一27)。也就是說在我實驗DDRT—

2、PCR陽性的EST中，Northern印跡的陽性比例僅為4／17。EST一30由電子拼接得到的eDNA長803bp，與Northern印跡檢測到的結(jié)果(800bp左右)一致。盡管這樣，但還需要檢測拼接的eDNA是否正確。這就需要依據(jù)拼接所得的cDNA中的開放閱讀框設(shè)計引物，用RTPCR方法從組織的mRNA擴增出相應(yīng)的，：r放閱讀框，經(jīng)測序加以驗證。經(jīng)RT～PCR所得的序列與電子拼接的cDNA中的開放閱讀框完全一致，編碼140個氮基酸。我

3、們暫命名它為鼻咽癌惡性行為相關(guān)基因1，NCM1(nasopharyngealcarcinomamalignantbehaviorrelatedgene1)。此基因已登記于GenBank，登記號為AY212270。NcM—t基因定位于染色體3q27，由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成。對氨基酸序列進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)無同源的己知蛋白序列，無保守結(jié)構(gòu)域，氨基酸殘基多數(shù)為親水性的。但它是否確為惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因，尚須做功能驗證。為此，我用pGEX2T構(gòu)

4、建了重組原核表達載體，并在原核細胞中表達此基因編碼的蛋白質(zhì)，擬用表達的蛋白免疫小鼠，制備相應(yīng)的單抗。我還用pCDNA3構(gòu)建了NCM～1的正義和反義重組真核表達載體。已將其轉(zhuǎn)染野生的CNE一2L2細胞，正用G418篩選。一旦篩選出NCM一1高表達及低表達的細胞克隆，就可在體內(nèi)外對此基因表達對CNE2L2細胞惡性生物學(xué)行為的影響進行進行研究。另一條EST(27)的Northern印跡檢測亦為陽性，長約16Kb，表明在CNE一2L2細胞中確實

5、存在著相應(yīng)的基因。但用EST拼接的方法只延伸到1194bp，序列中沒有讀碼框。我隨后用5’RACE方法擴增其5’末端，延伸了91bp，仍未得到完整的讀碼框。因此，我們正在構(gòu)建As細胞的eDNA文庫，擬采用經(jīng)典的篩選eDNA文庫的方法克隆其全長基因。隨著芯片技術(shù)的發(fā)展，可以用基因微陣列法高通量和快速地分析基因的差異表達。因此，我用含有已知原癌基因、抑癌基因和其它基因的芯片分析了AS與w細胞基因表達的差異。結(jié)果顯示AS細胞與W細胞相比，差異