人鼻咽癌惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的分析與克隆.pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文人鼻咽癌惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的分析與克隆姓名：靳玉蘭申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：朱立平20030601生里墜墊墮至!查莖墮堂魚(yú)堡苧EST)標(biāo)記成探針后，與As和w細(xì)胞的總RNA進(jìn)行Northern雜交，結(jié)果顯示有4條呈陽(yáng)性信號(hào)，與DDRT—PCR的結(jié)果一致。其中2條為代表已知基因的EST(EST一1，EST一20)，另2條為可拼接的EST(EST一30和EST一27)。也就是說(shuō)在我實(shí)驗(yàn)DDRT—

2、PCR陽(yáng)性的EST中，Northern印跡的陽(yáng)性比例僅為4／17。EST一30由電子拼接得到的eDNA長(zhǎng)803bp，與Northern印跡檢測(cè)到的結(jié)果(800bp左右)一致。盡管這樣，但還需要檢測(cè)拼接的eDNA是否正確。這就需要依據(jù)拼接所得的cDNA中的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物，用RTPCR方法從組織的mRNA擴(kuò)增出相應(yīng)的，：r放閱讀框，經(jīng)測(cè)序加以驗(yàn)證。經(jīng)RT～PCR所得的序列與電子拼接的cDNA中的開(kāi)放閱讀框完全一致，編碼140個(gè)氮基酸。我

3、們暫命名它為鼻咽癌惡性行為相關(guān)基因1，NCM1(nasopharyngealcarcinomamalignantbehaviorrelatedgene1)。此基因已登記于GenBank，登記號(hào)為AY212270。NcM—t基因定位于染色體3q27，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)同源的己知蛋白序列，無(wú)保守結(jié)構(gòu)域，氨基酸殘基多數(shù)為親水性的。但它是否確為惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因，尚須做功能驗(yàn)證。為此，我用pGEX2T構(gòu)

4、建了重組原核表達(dá)載體，并在原核細(xì)胞中表達(dá)此基因編碼的蛋白質(zhì)，擬用表達(dá)的蛋白免疫小鼠，制備相應(yīng)的單抗。我還用pCDNA3構(gòu)建了NCM～1的正義和反義重組真核表達(dá)載體。已將其轉(zhuǎn)染野生的CNE一2L2細(xì)胞，正用G418篩選。一旦篩選出NCM一1高表達(dá)及低表達(dá)的細(xì)胞克隆，就可在體內(nèi)外對(duì)此基因表達(dá)對(duì)CNE2L2細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響進(jìn)行進(jìn)行研究。另一條EST(27)的Northern印跡檢測(cè)亦為陽(yáng)性，長(zhǎng)約16Kb，表明在CNE一2L2細(xì)胞中確實(shí)

5、存在著相應(yīng)的基因。但用EST拼接的方法只延伸到1194bp，序列中沒(méi)有讀碼框。我隨后用5’RACE方法擴(kuò)增其5’末端，延伸了91bp，仍未得到完整的讀碼框。因此，我們正在構(gòu)建As細(xì)胞的eDNA文庫(kù)，擬采用經(jīng)典的篩選eDNA文庫(kù)的方法克隆其全長(zhǎng)基因。隨著芯片技術(shù)的發(fā)展，可以用基因微陣列法高通量和快速地分析基因的差異表達(dá)。因此，我用含有已知原癌基因、抑癌基因和其它基因的芯片分析了AS與w細(xì)胞基因表達(dá)的差異。結(jié)果顯示AS細(xì)胞與W細(xì)胞相比，差異