BioTAP-XL技術(shù)在Notch信號(hào)通路研究中的應(yīng)用及腺病毒蛋白E1A對(duì)Notch信號(hào)的影響.pdf

1、Notch信號(hào)通路是一條在進(jìn)化上高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，廣泛存在于脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物中。Notch信號(hào)的核心組件包括Notch受體、Notch配體、CSLDNA結(jié)合蛋白、下游靶基因等效應(yīng)分子等4部分。任何影響Notch配體、受體、CSL蛋白及效應(yīng)分子的因素都會(huì)對(duì)Notch信號(hào)的傳遞產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)異常與急性T淋巴白血病，B細(xì)胞淋巴瘤等多種血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。而受Notch信號(hào)通路調(diào)控的靶基因種類和和數(shù)目眾多，且

2、又具有一定的組織和細(xì)胞特異性。目前對(duì)Notch通路下游RBPJ轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的組成，及其在不同組織和器官中的靶基因種類和功能并不清楚，仍需進(jìn)行大量研究。BioTAP-XL(crosslinking/tandem affinity purification)是近年來開發(fā)的用于研究染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中轉(zhuǎn)錄因子，靶基因和RNA組成的一種新技術(shù)，并具有非常廣泛的應(yīng)用前景。人腺病毒是一類主要感染呼吸系統(tǒng)的病毒，此病毒除引起急性呼吸系統(tǒng)感染外，病毒DNA

3、可長(zhǎng)期存在于上呼吸道，淋巴組織的細(xì)胞內(nèi)形成潛伏感染，持續(xù)表達(dá)病毒蛋白。E1A(early region1A)蛋白是腺病毒侵染細(xì)胞后持續(xù)表達(dá)的最主要效應(yīng)蛋白。目前關(guān)于腺病毒蛋白E1A與Notch通路的關(guān)系并不明確，仍需進(jìn)行大量研究。
　　目的：
　　本研究擬評(píng)估BioTAP-XL技術(shù)在Notch信號(hào)通路的研究中應(yīng)用的可行性，及腺病毒蛋白E1A對(duì)Notch信號(hào)的影響。
　　方法及結(jié)果：
　　1.RBPJ-KO(D4c

4、ells)293T單克隆細(xì)胞系的建立。首先設(shè)計(jì)針對(duì)RBPJ的gRNA，然后使用分子克隆技術(shù)構(gòu)建RBPJ特異的CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒。后使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)篩選GFP陽性細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，挑取單克隆細(xì)胞后建系擴(kuò)大培養(yǎng)，Western Blot驗(yàn)證單克隆細(xì)胞系RBPJ的敲除情況，選取完全敲除的細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，得到RBPJ-KO(D4cells)293T單克隆細(xì)胞系。
　　2.RBPJ-BioTAP技術(shù)的應(yīng)用

5、。使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建RBPJ-BioTAP表達(dá)載體，然后制備病毒，感染RBPJ-KO(D4)293T細(xì)胞，挑取并建立相應(yīng)的單克隆細(xì)胞系。選取RBPJ-N-TAP的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過固定鉸鏈，串聯(lián)親和純化等步驟，最后使用質(zhì)譜分析RBPJ轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的組成，發(fā)現(xiàn)RBPJ-BioTAP的結(jié)果真實(shí)可靠。
　　3.E1A對(duì)Notch-RBPJ報(bào)告載體基因表達(dá)的激活作用。以E1A，RBPJ和Notch信號(hào)報(bào)告載體按照不同條件轉(zhuǎn)染感染R

6、BPJ-KO(D4)293T,U2OS和COS細(xì)胞，然后使用雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熒光素酶的活性，發(fā)現(xiàn)E1A-13S能激活Notch-RBPJ報(bào)告載體的基因表達(dá)，且這種激活作用能被DN-MAML抑制，而E1A-12S能抑制E1A-13S對(duì)Notch信號(hào)的激活作用。
　　4.E1A與Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白-RBPJ和MAML間的相互作用機(jī)制。通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)，E1A-13S既能與RBPJ結(jié)合，又能與MAML結(jié)合;而E

7、1A-12S只能與RBPJ結(jié)合。
　　5.E1A對(duì)依賴Notch信號(hào)細(xì)胞系增殖的影響。制備包含E1A的相應(yīng)病毒，然后分別感染細(xì)胞增殖需依賴Notch信號(hào)的人急性T淋巴細(xì)胞白血病的CUTALL細(xì)胞和乳腺癌的MB-157細(xì)胞，然后用Notch通路抑制劑GSI抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，流式細(xì)胞術(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)觀察表達(dá)E1A細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)E1A-13S不能使CUTALL細(xì)胞擺脫對(duì)Notch信號(hào)的依賴，但可通過上調(diào)c-Myc的表達(dá)

8、使MB-157細(xì)胞擺脫對(duì)Notch信號(hào)的依賴。
　　結(jié)論：
　　1.RBPJ-KO(D4cells)293T單克隆細(xì)胞系的建立，為以后在普通實(shí)驗(yàn)室條件使用CRISPR/Cas9敲除其他基因建立了技術(shù)平臺(tái)。
　　2.RBPJ-BioTAP技術(shù)真實(shí)可靠，為以后在其他血液腫瘤細(xì)胞系中使用BioTAP-XL技術(shù)研究Notch-RBPJ轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的組成及功能，及其他信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的組成，打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　3.腺

9、病毒蛋白E1A-13S能激活Notch信號(hào)，且這種激活作用能被DN-MAML抑制，E1A-12S能抑制E1A-13S對(duì)Notch信號(hào)的激活作用。
　　4.E1A-13S能與RBPJ和MAML結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，發(fā)揮類似Notch信號(hào)的作用;而E1A-12S只能與RBPJ結(jié)合。
　　5.E1A-13S不能使CUTALL細(xì)胞擺脫Notch信號(hào)的依賴，但可通過上調(diào)c-Myc的表達(dá)使MB-157細(xì)胞擺脫對(duì)Notch信號(hào)的依賴。