notch信號通路與血管發(fā)育

1、<p>　　Notch信號通路與血管發(fā)育</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 血管形成; Notch信號; 血管發(fā)生</p><p>　　血管發(fā)育是復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)形成的過程, 在個體發(fā)育、 組織再生、 腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用, 因此具有重要的研究價值。以往研究已經(jīng)證明, 血管發(fā)育與細胞因子、 組織缺氧、 基因調(diào)控等多種因素有關(guān)?，F(xiàn)就Notch信號通路在血管發(fā)育中的作用的研究進展

2、作一綜述。</p><p>　　1 Notch信號通路</p><p>　　Notch信號通路是進化中高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 其調(diào)控細胞增殖、 分化和凋亡的功能涉及幾乎所有組織和器官［1］。哺乳動物中有4個notch基因, 編碼4種Notch受體（Notch1, 2, 3, 4）。Notch前體蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)O巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(POFUT1)作用后, 在高爾基體中被Furin蛋白酶裂解成

3、兩部分, 二者通過非共價鍵相連, 形成細胞表面的異二聚體受體。胞外結(jié)構(gòu)域（NECD）含29～36個EGF樣重復(fù)序列（EGFlike repeats）和3個富含半胱氨酸的Notch/LIN12重復(fù)序列(Notch/LIN12 repeats), 其中, EGF樣重復(fù)序列是配體結(jié)合所必需的, 而Notch/LIN12重復(fù)序列與抑制配體非依賴的Notch信號活化有關(guān)。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）主要由核定位信號序列（NLS）, 6個串聯(lián)

4、的富含天冬酰胺的錨蛋白重復(fù)序列（tandem ankyrin repeats）和羧基端的PEST序列組成, 其中錨蛋白重復(fù)序列介導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與下游信號分子結(jié)合, PEST序列有助于加速蛋白水解酶對NICD的降解。</p><p>　　目前在哺乳動物發(fā)現(xiàn)5種Notch配體, 分別為Deltalike1、 3、 4（Dll1、 3、 4）和Jagged1、 2（與果蠅Serrate/Lag2蛋白同源), 亦可被共

5、同稱為DSL（Delta/Serrate/Lag2）。該配體的胞外部分由氨基端的DSL結(jié)構(gòu)域和下游數(shù)目可變的EGF樣重復(fù)序列構(gòu)成, DSL結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)與受體的結(jié)合, 該結(jié)構(gòu)域的泛素化是Notch配體活化的關(guān)鍵步驟, 這一過程需要E3泛素連接酶Mindbomb（Mib）的催化。另外, 泛素結(jié)合蛋白Epsin的活性是泛素化DSL發(fā)生胞吞作用, 進而激活Notch所必需的。</p><p>　　Notch信號的活

6、化需要細胞間的直接接觸。當配體與受體結(jié)合后, 激活金屬蛋白酶家族的腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶(TACE), TACE切去受體的大部分NECD, 由此引發(fā)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化, 使之易受γsecretase/Presenilins作用發(fā)生第二次剪切, 最終釋放NICD, NICD隨即轉(zhuǎn)移至核內(nèi), 與DNA結(jié)合蛋白RBPJ（又名CSL, 即哺乳動物中CBF1、 果蠅中Su(H) 、 線蟲中LAG1的合稱）結(jié)合。RBPJ與NICD結(jié)合之前為轉(zhuǎn)

7、錄抑制因子, 結(jié)合NICD之后, RBPJ募集共激活分子, 進而啟動Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已知的Notch靶基因多為編碼堿性螺旋環(huán)螺旋家族轉(zhuǎn)錄因子的基因, 包括Hes(Hairy/Enhancer of Split)和Hey(Hesrelated protein)。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠進一步調(diào)控下游分子的表達［1］。此外, Notch信號通路還存在一條不依賴RBPJ的途徑, 這可能與細胞膜上另一類Notch受體, 即由未經(jīng)剪

8、切的完整Notch前體蛋白組成的受體有關(guān)［2］。</p><p><b>　　2 血管發(fā)育</b></p><p>　　胚胎發(fā)育早期分化出現(xiàn)成血管細胞（angioblasts）, 即內(nèi)皮前體細胞（endothelial precursor cells, EPCs）, 融合后形成初級毛細血管叢, 這一過程稱為血管發(fā)生（vasculogenesis）。隨著發(fā)育的進行,

9、初級毛細血管叢改建為由不同等級的動靜脈及毛細血管構(gòu)成的血管網(wǎng), 這一過程即為血管形成（angiogenesis）。血管形成起始于一部分內(nèi)皮細胞的極性改變, 伸出絲狀偽足, 獲得遷移及侵襲能力。這些細胞被稱為尖端細胞（tip cell）, 而其相鄰的內(nèi)皮細胞不發(fā)生此類變化。尖端細胞位于新生血管的最前端, 其絲狀偽足向前伸展, 能夠充分接受周圍組織中各種生長因子的信號, 尤其是血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）［3］, 并受到周細胞（peri

10、cyte）的接觸抑制及部分細胞外基質(zhì)蛋白的調(diào)控。同時, 尖端細胞產(chǎn)生血小板源性生長因子（PDGF）, 為新生血管募集更多周細胞, 最終形成結(jié)構(gòu)完整的血管［4］。尖端細胞偽足的伸展為血管新生指示了方向, 而真正形成結(jié)構(gòu)完整功能健全的血管則需要管腔化（tubulogenesis）過程。以小鼠視網(wǎng)膜血管為模型的研究提</p><p>　　3 Notch信號通路與血管發(fā)生</p><p>　　3

11、.1 Notch信號與動靜脈分化 既往認為, 內(nèi)皮細胞的動靜脈分化依賴血流物理學(xué)特性的調(diào)節(jié)。最近研究卻表明, 血管內(nèi)皮細胞的分化主要受Notch信號調(diào)控, 內(nèi)皮細胞在有血流灌注之前即已形成其動靜脈分化特征［6］。Lawson等的研究表明: 斑馬魚mindbomb基因的功能缺失突變抑制動靜脈分化, 表現(xiàn)為動脈標記物EphrinB2在動脈內(nèi)皮細胞中表達缺失。EphrinB2是一種相對分子質(zhì)量較小的跨膜蛋白, 其受體EphB4為酪氨酸激酶

12、受體, 通常作為靜脈標記物僅表達于靜脈系統(tǒng), 而在mindbomb突變體的動脈內(nèi)皮中卻發(fā)現(xiàn)了EphB4的異位表達。反之, mindbomb在靜脈中的過度活化導(dǎo)致ephB4的表達下調(diào)。形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn), mindbomb突變體存在明顯動靜脈畸形［7］。斑馬魚gridlock基因的功能缺失突變也能導(dǎo)致類似的變化, gridlock與哺乳動物hey2同源［8］。由于gridlock基因僅抑制靜脈標記物的表達, 而并未增加動脈標記物的表達, 提示

13、gridlock的功能在于抑制靜脈分化, 而非促進動脈分化。在小鼠中, Notch信號通路也被證實為調(diào)控動靜脈分化的主</p><p>　　3.2 Notch信號與尖端細胞 Notch信號通路在尖端細胞的選擇中起重要作用。Dll4在新生血管尖端有較高活性。盡管多數(shù)Dll4突變型個體在胚胎期即已死亡, 少數(shù)存活的個體卻表現(xiàn)出內(nèi)皮細胞過度增生, 血管分支數(shù)目增多, 血管密度明顯升高, 尖端細胞標志物血小板源性生長

14、因子b（Pdgfb）和神經(jīng)生長因子受體（Netrin receptor, Unc5b）上調(diào)。應(yīng)用重組可溶性Dll4/Fc蛋白或Dll4mAb封閉Dll4分子, 或應(yīng)用γsecretase抑制劑DAPT抑制NICD形成也可以產(chǎn)生類似結(jié)果［10, 11］。在Rbpsuh水平阻斷Notch信號的活化也能夠?qū)е录舛思毎麛?shù)目增多, 新生血管出現(xiàn)異常分支, 同時, 實時影像研究顯示, 生長中的斑馬魚體節(jié)間血管表現(xiàn)出增強的伸展行為［12］。上述研究

15、提示, Dll4Notch通路能夠抑制尖端細胞的形成, 從而減少由尖端細胞引導(dǎo)的血管分支的產(chǎn)生。</p><p>　　為了進一步了解Notch信號對尖端細胞結(jié)構(gòu)功能的影響, 應(yīng)用三維體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的研究表明, 活化的Dll4Notch信號能夠抑制VEGFA誘導(dǎo)的內(nèi)皮出芽［13］。在過表達Dll4的實驗性腫瘤中, 瘤體血流灌注良好, 血管分支及內(nèi)皮細胞增生減少［14］。以上研究結(jié)果提示, 在血管發(fā)生過程中,

16、新生血管尖端的缺氧環(huán)境及VEGFA誘導(dǎo)一部分內(nèi)皮細胞表達Dll4, Dll4作用于相鄰內(nèi)皮細胞膜上的Notch受體, 通過下調(diào)VEGFAR的表達維持此類細胞的靜止狀態(tài), 而表達Dll4的細胞則獲得尖端細胞的特性, 形成絲狀偽足進一步接受更多VEGFA信號, 并引導(dǎo)新生血管沿VEGFA濃度梯度生長。Dll4與Notch協(xié)同作用保證血管發(fā)生適度而有序的進行。Notch信號在新生血管管腔化過程中的作用也得到了實驗結(jié)果的支持, 過表達Notch

17、4 NICD的小鼠表現(xiàn)出明顯的血管腔擴大［15］, 提示Notch信號對血管出芽及分支的抑制作用可能促進了管腔化, 進而在血管發(fā)育過程中協(xié)調(diào)整合這兩個過程。</p><p>　　3.3 Notch信號與血管平滑肌細胞的分化 既往研究結(jié)果表明, Notch抑制體外培養(yǎng)的平滑肌細胞分化, 這一作用可能與Hey2有關(guān)。然而, 最近更多的研究卻提示: Notch信號能夠誘導(dǎo)平滑肌細胞分化。Jagged1介導(dǎo)的Notc

18、h信號促進人主動脈平滑肌細胞及小鼠胚胎纖維母細胞的分化［16］。平滑肌細胞中的肌球蛋白重鏈及α肌動蛋白均被證實為Notch信號作用的靶分子。</p><p>　　當血管受損時, 血管平滑肌中各種Notch通路的分子表達水平發(fā)生變化, 如Notch1、 Notch3、 Jagged1、 Jagged2、 Hey1和Hey2。與未受損的對照組相比, 這些分子在損傷后最初2 d內(nèi)表達下調(diào), 在7～14 d內(nèi)上調(diào)。體外培

19、養(yǎng)完全敲除hey2的主動脈平滑肌細胞增生速度較野生型慢, 而過表達Hey1或Hey2的細胞增生速度加快, 同時細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑P27kip1（Cdkn1b）減少, 提示Hey2蛋白直接作用于P27kip1啟動子抑制其轉(zhuǎn)錄［17］。在模擬循環(huán)血流的機械牽拉作用下, 體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中Notch1和Notch3表達明顯下調(diào), 血管平滑肌分化標志物表達升高, 同時, 細胞增生減少, 凋亡增多。過表達Notch1或Notch

20、3能夠使上述細胞的增生及凋亡水平恢復(fù)［18］。上述研究提示, 循環(huán)血流機械牽拉作用抑制血管平滑肌細胞增生及促進凋亡的作用受到Notch信號通路的調(diào)節(jié)。</p><p>　　3.4 Notch信號與成體動脈形成 在成體循環(huán)系統(tǒng)中, 當局部動脈血流受阻時（如血栓栓塞, 動脈粥樣硬化性血管狹窄等）, 受阻動脈發(fā)出側(cè)支血管, 以重建缺血組織的血流供應(yīng), 這一過程被稱為動脈形成（arteriogenesis）, 它以局

21、部增加的血流剪應(yīng)力為起始因素, 還涉及炎細胞活化, 內(nèi)皮增生及細胞外基質(zhì)重塑等［19］。最近的研究表明, Dll1是動脈形成的關(guān)鍵調(diào)控分子。Dll1僅在動脈內(nèi)皮中表達, 并于局部缺血誘導(dǎo)的新生動脈中表達上調(diào)。在Dll1雜合子的后肢缺血模型中發(fā)現(xiàn)其動脈側(cè)枝生成減少, 血流重建不完全［20］, 同時, 由缺血誘導(dǎo)的Notch信號活化及EphrinB2表達上調(diào)均受到抑制。類似的表現(xiàn)也出現(xiàn)于Notch1雜合子中［21］。</p>

22、<p>　　3.5 Notch信號與腫瘤血管生成 在多數(shù)實體瘤中, VEGFA表達明顯升高。應(yīng)用VEGFAmAb能夠抑制嚙齒動物腫瘤的生長。然而在前期臨床實驗中, VEGFAmAb與傳統(tǒng)化療結(jié)合應(yīng)用僅能提高患者總體生存率, 部分腫瘤耐藥［22］。鑒于Notch信號通路在血管發(fā)育中的關(guān)鍵作用, 及Dll4在VEGFA依賴的新生腫瘤血管中的高水平表達, 可將Dll4作為抗腫瘤藥物的新靶點。在小鼠異種移植腫瘤模型中, 應(yīng)用Dll

23、4mAb, Dll4/Fc融合蛋白, 或γsecretase抑制劑均能夠抑制瘤體生長, 新生腫瘤血管盡管分支數(shù)目增加, 血管密度增大, 但是血管功能低下, 導(dǎo)致腫瘤組織血流灌注減少, 呈缺氧狀態(tài)。此外, 抗Dll4治療也可抑制VEGF抑制劑耐藥實體瘤的生長［14］。</p><p>　　3.6 Notch信號與血管病變 Alagille syndrome（AGS）是一種常染色體遺傳性疾病。病變主要累及肝臟、

24、 心臟、 眼和骨骼。多數(shù)AGS患者存在JAG1基因突變, 少部分為Notch2突變［23］。發(fā)病機制可能與Notch信號對心臟神經(jīng)嵴細胞（cardiac neural crest cells）向血管平滑肌細胞分化的調(diào)控相關(guān)。</p><p>　　伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病 (CADASIL)是一種反復(fù)發(fā)作缺血性腦卒中, 逐漸出現(xiàn)多發(fā)性腦梗死和癡呆的非動脈硬化性、 非淀粉樣變性腦血管病。其

25、主要病理表現(xiàn)為血管平滑肌細胞的進行性變性及嗜鋨顆粒（GOM）沉積。Notch3在CADASIL發(fā)病過程中的重要性已經(jīng)得到公認, 但其具體的發(fā)病機制是由于Notch3 介導(dǎo)的信號缺失［24］, 還是由于Notch3 胞外區(qū)域不能有效被清除目前尚不能確定。嗜鋨顆粒是否由過量積聚的Notch3胞外區(qū)域所組成也存在爭議。目前研究發(fā)現(xiàn), 在大多數(shù)Notch3相關(guān)的的CADASIL患者中, 存在由Notch3基因的錯義突變而導(dǎo)致的胞外34個EGF

26、樣重復(fù)序列中的一個序列增加或缺少一個半胱氨酸殘基, 打破了原有的二硫鍵的形成, 改變了蛋白質(zhì)構(gòu)象, 干擾了受體與配體之間的相互作用, 也可能導(dǎo)致了受體胞外區(qū)域在血管平滑肌細胞的堆積。這一發(fā)現(xiàn)在一定程度上提示了CADASIL的發(fā)病機制。</p><p><b>　　4 展望</b></p><p>　　目前已有大量研究證實了Notch信號通路在血管發(fā)生各個階段中的

27、作用, 如對尖端細胞的選擇, 誘導(dǎo)動靜脈分化及促進平滑肌細胞分化。然而, Notch信號通路在這些過程中的具體作用機制目前還不清楚, Notch與其他信號通路之間是否存在相互作用及其作用機制尚不明確。Notch信號通路在血管發(fā)生過程中是否存在其他重要作用仍需進一步研究。此外, 鑒于實體瘤生長轉(zhuǎn)移對血管發(fā)生的依賴性, 對Notch通路中各個關(guān)鍵分子的研究為抑制腫瘤血管發(fā)生及腫瘤生長提供了新靶點。Dll4是目前發(fā)現(xiàn)的Notch通路中最有應(yīng)用

28、前景的抗腫瘤靶點, 是否存在其他與腫瘤血管發(fā)生密切相關(guān)的分子, 以及這些分子的應(yīng)用價值仍有待發(fā)現(xiàn)。另外, Notch信號與某些先天性疾病的關(guān)系為闡明此類疾病的發(fā)生機制及開發(fā)治療新方法提出了可能。</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　?。?］ ArtavanisTsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch si

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