負性共刺激分子PD-L1在非小細胞肺癌腫瘤微環(huán)境中的表達特征以及臨床意義.pdf

1、腫瘤微環(huán)境主要是由腫瘤細胞和間質(zhì)細胞構(gòu)成的，兩者相互影響共同促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。免疫細胞特別是單核巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中構(gòu)成間質(zhì)細胞的重要群體，可以通過影響免疫監(jiān)視、腫瘤血管新生和腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移等方式參與腫瘤進展的整個病理進程。因此，分析腫瘤微環(huán)境中癌細胞和腫瘤浸潤單核巨噬細胞的特性和功能對于了解腫瘤生物學特征和進展狀態(tài)具有重要的意義。本論文以負性共刺激分子 PD-L1為切入點，以肺癌的不同部位的癌細胞和單核巨噬細胞為研究對象，對比

2、研究肺癌微環(huán)境中PD-L1表達特點、臨床意義和生物學特征。
　　第一部分：PD-L1在非小細胞肺癌細胞的表達特征以及臨床意義
　　目的：檢測非小細胞肺癌組織中負性共刺激分子PD-L1的表達，探討PD-L1在非小細胞肺癌中表達的臨床意義和生物學功能。
　　方法：收集蘇州大學附屬第一醫(yī)院初診肺癌患者手術(shù)切除的非小細胞肺癌標本102例，通過免疫組織化學技術(shù)分析PD-L1蛋白在腫瘤細胞的表達，同時結(jié)合患者的臨床資料，分析 PD

3、-L1蛋白在非小細胞肺癌腫瘤細胞中的表達與患者臨床資料參數(shù)之間的相關(guān)性。流式細胞術(shù)檢測癌組織中浸潤CD3+T細胞及CD8+T細胞數(shù)量，并分析其與腫瘤細胞PD-L1表達水平的關(guān)系；運用PD-L1阻斷性抗體分析肺癌A549細胞表達的PD-L1在T細胞體外增殖中的生物學作用。
　　結(jié)果：1．在102例非小細胞肺癌中62例（60.78％）腫瘤細胞PD-L1蛋白呈高表達，但在癌旁肺上皮細胞和腫瘤遠端的正常肺上皮細胞不表達PD-L1；2．PD

4、-L1在非小細胞肺癌腫瘤細胞中的表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)（P<0.01），而與性別、年齡、腫瘤大小、病理類型及分化程度之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（P>0.05）；結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)分析顯示，腫瘤細胞PD-L1蛋白的表達水平與患者生存期有關(guān)，PD-L1高表達的患者生存時間較短，預后較差（P<0.05）；3.與PD-L1低表達的腫瘤組織相比，PD-L1高表達的腫瘤組織中浸潤CD8+T細胞數(shù)量減少（P<0.05），CD3+T細胞數(shù)量無明顯變化（

5、P>0.05）；4．PD-L1阻斷型抗體提高了與A549細胞共培養(yǎng)的T細胞的體外增殖（P<0.05）。
　　結(jié)論：1．PD-L1蛋白在非小細胞肺癌腫瘤細胞高表達，非腫瘤組織的肺上皮細胞不表達PD-L1；2．PD-L1表達水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及預后密切相關(guān)；3． PD-L1表達水平與腫瘤浸潤CD8+T細胞數(shù)量相關(guān)，阻斷腫瘤細胞PD-1/PD-L1信號可以顯著提高與腫瘤細胞共培養(yǎng)的T細胞的體外增殖。由此表明，PD-L1在腫瘤

6、細胞上表達是非小細胞肺癌腫瘤微環(huán)境中抑制T細胞免疫應(yīng)答的重要機制。
　　第二部分：PD-L1在非小細胞肺癌患者不同組織CD14+單核/巨噬細胞表達的特征及其臨床意義
　　目的：腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）是一群在實體瘤組織中浸潤的以CD45+CD14+為表型特征的單核樣髓系來源細胞。作為重要的抗原遞呈細胞，TAM在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮了重要作用。本文旨在分析PD-L1在非

7、小細胞肺癌患者不同部位組織浸潤 CD14+單核/巨噬細胞上的表達特征，并探討其臨床意義。
　　方法：1.收集60例非小細胞肺癌癌灶組織以及對應(yīng)的癌遠端肺組織標本和部分對應(yīng)的外周血標本，檢測PD-L1在組織以及外周血中的單核/巨噬細胞上的表達特征；2.結(jié)合病例資料分析 PD-L1在單核/巨噬細胞上表達的臨床意義；3.LLC細胞構(gòu)建小鼠肺癌模型，分析不同的時間點單核巨噬細胞上 PD-L1表達的規(guī)律；4.用阻斷性抗PD-L1抗體干擾PD

8、-1/PD-L1信號，探討PD-L1在單核巨噬細胞上發(fā)揮的生物學功能。
　　結(jié)果：1.與癌遠端肺組織浸潤巨噬細胞相比，PD-L1在癌灶組織浸潤 CD14+單核/巨噬細胞的表達顯著升高（P<0.01）；2.腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)浸潤CD14+單核/巨噬細胞上 PD-L1表達水平顯著高于對應(yīng)的非腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)浸潤巨噬細胞（P<0.01）；3.結(jié)合患者病理資料分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1在癌灶組織浸潤 CD14+單核/巨噬細胞上的表達水平與腫瘤分期以及

9、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）；4.動態(tài)監(jiān)測LLC荷瘤小鼠不同的時間點單核/巨噬細胞上PD-L1表達發(fā)現(xiàn)，隨著荷瘤時間的延長和腫瘤負荷增加，PD-L1在單核/巨噬細胞上的表達也隨之增加；5.功能學實驗證實，PD-L1阻斷型抗體可以逆轉(zhuǎn)單核/巨噬細胞介導的T細胞增殖抑制（P<0.01）。
　　結(jié)論：1. PD-L1在非小細胞肺癌浸潤單核/巨噬細胞上表達增高，其表達水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期密切相關(guān)；2.隨著腫瘤負荷的增加，

10、單核/巨噬細胞上表達的PD-L1也逐步增加；3.阻斷PD-1/PD-L1信號途徑可以逆轉(zhuǎn)單核/巨噬細胞對T細胞增殖的抑制作用。由此表明，PD-L1在單核/巨噬細胞上表達是非小細胞肺癌腫瘤微環(huán)境中抑制T細胞免疫應(yīng)答的重要機制。
　　綜上所述，本研究以PD-L1為切入點，從腫瘤微環(huán)境中的癌細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞入手，通過免疫組織化學和流式細胞檢測的方法，檢測了肺癌患者不同組織及不同部位 PD-L1的表達情況，并結(jié)合臨床資料進行分析，得

11、出以下有價值的結(jié)論：
　?。?）肺癌細胞高表達 PD-L1，其表達水平與患者生存期呈負相關(guān)；癌細胞PD-L1表達水平與浸潤的CD8+T細胞數(shù)量相關(guān)，功能學實驗提示PD-L1在肺癌細胞株上表達能夠抑制T細胞體外增殖。
　?。?）肺癌癌灶浸潤巨噬細胞上高表達PD-L1，其表達水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)；荷瘤動物模型證實 PD-L1表達與腫瘤進展密切相關(guān)；功能學實驗也證實單核巨噬細胞上PD-L1可以抑制T細胞體外增殖。