負(fù)性共刺激分子PD-L1在非小細(xì)胞肺癌腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)特征以及臨床意義.pdf

1、腫瘤微環(huán)境主要是由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的，兩者相互影響共同促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。免疫細(xì)胞特別是單核巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中構(gòu)成間質(zhì)細(xì)胞的重要群體，可以通過影響免疫監(jiān)視、腫瘤血管新生和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等方式參與腫瘤進(jìn)展的整個病理進(jìn)程。因此，分析腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞和腫瘤浸潤單核巨噬細(xì)胞的特性和功能對于了解腫瘤生物學(xué)特征和進(jìn)展?fàn)顟B(tài)具有重要的意義。本論文以負(fù)性共刺激分子 PD-L1為切入點(diǎn)，以肺癌的不同部位的癌細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞為研究對象，對比

2、研究肺癌微環(huán)境中PD-L1表達(dá)特點(diǎn)、臨床意義和生物學(xué)特征。
　　第一部分：PD-L1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的表達(dá)特征以及臨床意義
　　目的：檢測非小細(xì)胞肺癌組織中負(fù)性共刺激分子PD-L1的表達(dá)，探討PD-L1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的臨床意義和生物學(xué)功能。
　　方法：收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院初診肺癌患者手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本102例，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)分析PD-L1蛋白在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，同時結(jié)合患者的臨床資料，分析 PD

3、-L1蛋白在非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與患者臨床資料參數(shù)之間的相關(guān)性。流式細(xì)胞術(shù)檢測癌組織中浸潤C(jī)D3+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞數(shù)量，并分析其與腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的關(guān)系；運(yùn)用PD-L1阻斷性抗體分析肺癌A549細(xì)胞表達(dá)的PD-L1在T細(xì)胞體外增殖中的生物學(xué)作用。
　　結(jié)果：1．在102例非小細(xì)胞肺癌中62例（60.78％）腫瘤細(xì)胞PD-L1蛋白呈高表達(dá)，但在癌旁肺上皮細(xì)胞和腫瘤遠(yuǎn)端的正常肺上皮細(xì)胞不表達(dá)PD-L1；2．PD

4、-L1在非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)（P<0.01），而與性別、年齡、腫瘤大小、病理類型及分化程度之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（P>0.05）；結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)分析顯示，腫瘤細(xì)胞PD-L1蛋白的表達(dá)水平與患者生存期有關(guān)，PD-L1高表達(dá)的患者生存時間較短，預(yù)后較差（P<0.05）；3.與PD-L1低表達(dá)的腫瘤組織相比，PD-L1高表達(dá)的腫瘤組織中浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞數(shù)量減少（P<0.05），CD3+T細(xì)胞數(shù)量無明顯變化（

5、P>0.05）；4．PD-L1阻斷型抗體提高了與A549細(xì)胞共培養(yǎng)的T細(xì)胞的體外增殖（P<0.05）。
　　結(jié)論：1．PD-L1蛋白在非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，非腫瘤組織的肺上皮細(xì)胞不表達(dá)PD-L1；2．PD-L1表達(dá)水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)；3． PD-L1表達(dá)水平與腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，阻斷腫瘤細(xì)胞PD-1/PD-L1信號可以顯著提高與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的T細(xì)胞的體外增殖。由此表明，PD-L1在腫瘤

6、細(xì)胞上表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌腫瘤微環(huán)境中抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要機(jī)制。
　　第二部分：PD-L1在非小細(xì)胞肺癌患者不同組織CD14+單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)的特征及其臨床意義
　　目的：腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）是一群在實(shí)體瘤組織中浸潤的以CD45+CD14+為表型特征的單核樣髓系來源細(xì)胞。作為重要的抗原遞呈細(xì)胞，TAM在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮了重要作用。本文旨在分析PD-L1在非

7、小細(xì)胞肺癌患者不同部位組織浸潤 CD14+單核/巨噬細(xì)胞上的表達(dá)特征，并探討其臨床意義。
　　方法：1.收集60例非小細(xì)胞肺癌癌灶組織以及對應(yīng)的癌遠(yuǎn)端肺組織標(biāo)本和部分對應(yīng)的外周血標(biāo)本，檢測PD-L1在組織以及外周血中的單核/巨噬細(xì)胞上的表達(dá)特征；2.結(jié)合病例資料分析 PD-L1在單核/巨噬細(xì)胞上表達(dá)的臨床意義；3.LLC細(xì)胞構(gòu)建小鼠肺癌模型，分析不同的時間點(diǎn)單核巨噬細(xì)胞上 PD-L1表達(dá)的規(guī)律；4.用阻斷性抗PD-L1抗體干擾PD

8、-1/PD-L1信號，探討PD-L1在單核巨噬細(xì)胞上發(fā)揮的生物學(xué)功能。
　　結(jié)果：1.與癌遠(yuǎn)端肺組織浸潤巨噬細(xì)胞相比，PD-L1在癌灶組織浸潤 CD14+單核/巨噬細(xì)胞的表達(dá)顯著升高（P<0.01）；2.腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)浸潤C(jī)D14+單核/巨噬細(xì)胞上 PD-L1表達(dá)水平顯著高于對應(yīng)的非腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)浸潤巨噬細(xì)胞（P<0.01）；3.結(jié)合患者病理資料分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1在癌灶組織浸潤 CD14+單核/巨噬細(xì)胞上的表達(dá)水平與腫瘤分期以及

9、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）；4.動態(tài)監(jiān)測LLC荷瘤小鼠不同的時間點(diǎn)單核/巨噬細(xì)胞上PD-L1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，隨著荷瘤時間的延長和腫瘤負(fù)荷增加，PD-L1在單核/巨噬細(xì)胞上的表達(dá)也隨之增加；5.功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PD-L1阻斷型抗體可以逆轉(zhuǎn)單核/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖抑制（P<0.01）。
　　結(jié)論：1. PD-L1在非小細(xì)胞肺癌浸潤單核/巨噬細(xì)胞上表達(dá)增高，其表達(dá)水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期密切相關(guān)；2.隨著腫瘤負(fù)荷的增加，

10、單核/巨噬細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1也逐步增加；3.阻斷PD-1/PD-L1信號途徑可以逆轉(zhuǎn)單核/巨噬細(xì)胞對T細(xì)胞增殖的抑制作用。由此表明，PD-L1在單核/巨噬細(xì)胞上表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌腫瘤微環(huán)境中抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要機(jī)制。
　　綜上所述，本研究以PD-L1為切入點(diǎn)，從腫瘤微環(huán)境中的癌細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞入手，通過免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞檢測的方法，檢測了肺癌患者不同組織及不同部位 PD-L1的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析，得

11、出以下有價值的結(jié)論：
　?。?）肺癌細(xì)胞高表達(dá) PD-L1，其表達(dá)水平與患者生存期呈負(fù)相關(guān)；癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平與浸潤的CD8+T細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，功能學(xué)實(shí)驗(yàn)提示PD-L1在肺癌細(xì)胞株上表達(dá)能夠抑制T細(xì)胞體外增殖。
　?。?）肺癌癌灶浸潤巨噬細(xì)胞上高表達(dá)PD-L1，其表達(dá)水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)；荷瘤動物模型證實(shí) PD-L1表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)；功能學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)單核巨噬細(xì)胞上PD-L1可以抑制T細(xì)胞體外增殖。