AML1-ETO9a的產(chǎn)生機(jī)制及惡性血液病侵襲性真菌病的二級(jí)預(yù)防.pdf

1、第一章在t(8;21)AML中選擇性剪切體AML1-ETO9a產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制
　　目的:染色體易位是急性髓系白血病(AML)最常見的細(xì)胞遺傳學(xué)異常。t(8;21)(q22;q22)是AML中最常見的染色體易位，易位形成的AML1-ETO融合基因是t(8;21)AML的顯著特征和始發(fā)因素，同時(shí)，存在其他的事件協(xié)同引起AML的發(fā)生。研究證實(shí)，AML1-ETO的選擇性剪切體AML1-ETO9a與此類白血病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，但A

2、ML1-ETO9a產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。
　　材料與方法:
　　1、收集21例AML1-ETO陽(yáng)性配對(duì)樣本（同一患者不同病程的樣本，包含初治或者復(fù)發(fā)的樣本以及緩解的樣本），2例AML1-ETO陰性（也屬于AML-M2患者）配對(duì)樣本，進(jìn)行外顯子高通量測(cè)序分析體細(xì)胞突變數(shù);對(duì)23例樣本的突變基因重現(xiàn)性分析;
　　2、從大量AML臨床樣本和正常人骨髓表達(dá)芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中，分析不同染色體核型樣本中，富含絲氨酸/精氨酸剪接因子

3、(SRSF)總體上的表達(dá)水平;分析22例AML1-ETO陽(yáng)性、22例AML1-ETO陰性和5例正常人骨髓中表達(dá)芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，找出在AML1-ETO陽(yáng)性樣本中異常高表達(dá)的剪切因子SRSF2、SRSF6和SRSF11;克隆ETO9a外顯子及其側(cè)翼序列，體外轉(zhuǎn)錄，RNA沉淀(RIP)，質(zhì)譜分析，對(duì)所得到的145個(gè)差異且有意義的蛋白進(jìn)行信號(hào)途徑分析;Western blot對(duì)RIP及質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;
　　3、構(gòu)建SRSF2的慢病毒表達(dá)載體

4、，轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，證實(shí)SRSF2對(duì)選擇性剪切體AML1-ETO9a產(chǎn)生的影響，以及對(duì)AML1-ETO陽(yáng)性和陰性的細(xì)胞增殖及惡性表型的影響;
　　4、生物信息學(xué)分析及熒光素酶驗(yàn)證AML1-ETO9a是miR-9-1的靶基因;熒光定量PCR檢測(cè)miR-9-1在細(xì)胞系和臨床樣本中的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、外顯子高通量測(cè)序結(jié)果表明:23例樣本，每個(gè)初治或者復(fù)發(fā)樣本的體細(xì)胞平均突變位點(diǎn)數(shù)目為18.6個(gè)

5、，突變基因重現(xiàn)性統(tǒng)計(jì)，分析可能存在的共性基因突變，其中重現(xiàn)性最高的基因是c-KIT，其重現(xiàn)性為17.4％(4/23)，其次為NRAS占13％(3/23)，F(xiàn)LT3、NOTCH1、PHF6各占8.7％(2/23)?？偨Y(jié)蘇州大學(xué)和我們的臨床樣本分析數(shù)據(jù)以及美國(guó)UCSD張東爾教授的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AML1-ETO9a在AML1-ETO陽(yáng)性的臨床樣本中所占得比例分別為100％(44/44)、100％(10/10)和95％(35/37)，均遠(yuǎn)高于c-K

6、IT突變。
　　2、在t(8;21)AML中，SRSF總體上的表達(dá)明顯比其它各型染色體異常AML臨床樣本中高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SRSF2、SRSF6、SRSF11這三個(gè)剪切因子在AML1-ETO陽(yáng)性的AML中異常高表達(dá)。
　　3、用ETO9a外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行的RIP及質(zhì)譜分析，對(duì)有差異的145個(gè)有意義的蛋白進(jìn)行信號(hào)途徑分析發(fā)現(xiàn)，超過82％(119/145)的蛋白與核mRNA的剪切、加工、剪切復(fù)合體的裝配、調(diào)控密切相關(guān)，

7、其它的18％(26/145)蛋白則負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞的凋亡和死亡。SRSF2的慢病毒轉(zhuǎn)染AML1-ETO陽(yáng)性的細(xì)胞株Kasumi-1和SKNO-1，定量PCR檢測(cè)AML1-ETO和AML1-ETO9a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在這兩種細(xì)胞系中AML1-ETO9a的表達(dá)量顯著提高，分別從13％和7.5％提高到54.2％和50.6％,證實(shí)SRSF2可以導(dǎo)致AML1-ETO9a選擇性剪切體的產(chǎn)生，克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SRSF2可特異性地調(diào)控AML1-

8、ETO融合基因陽(yáng)性細(xì)胞的惡性增殖，而對(duì)AML1-ETO陰性的細(xì)胞系如HL-60則沒有影響。
　　4、生物信息學(xué)分析、熒光素酶報(bào)道載體及Western blot證實(shí)，AML1、AML1-ETO、AML1-ETO9a都是miR-9-1的靶基因，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)miR-9-1在t(8;21)AML表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論:
　　1、從遺傳學(xué)、基因結(jié)構(gòu)、基因功能及重現(xiàn)性上來說，AML1-ETO9a是t(8;21)AML

9、一個(gè)更為普遍的“第二次打擊”;
　　2、在轉(zhuǎn)錄/剪切水平上，剪切因子SRSF2促進(jìn)了AML1-ETO9a的選擇性剪切，并且特異性地促進(jìn)了AML1-ETO陽(yáng)性細(xì)胞的惡性增殖;
　　3、翻譯水平上，AML1-ETO9a是miR-9-1的一個(gè)靶基因，miR-9-1可以抑制AML1-ETO9a的蛋白翻譯，而miR-9-1在t(8;21) AML中表達(dá)明顯降低，從而導(dǎo)致AML1-ETO9a大量翻譯出蛋白，導(dǎo)致t(8;21)AML的發(fā)生

10、。
　　第二章惡性血液病患者中侵襲性真菌病的二級(jí)預(yù)防
　　目的:侵襲性真菌病(IFD)在惡性血液病患者中發(fā)病率和死亡率均很高，有IFD病史的患者在進(jìn)一步的化療或造血干細(xì)胞移植(HSCT)中，IFD復(fù)燃率高，預(yù)后差。二級(jí)預(yù)防(SAP)可有效地預(yù)防IFD復(fù)燃。本研究旨在探討有IFD病史的惡性血液病患者接受進(jìn)一步的化療或HSCT時(shí)進(jìn)行SAP的策略和療效，分析SAP失敗的危險(xiǎn)因素。
　　材料與方法:回顧性分析了2008年1月至

11、2013年6月就診于該院血液科接受化療或HSCT且既往有IFD病史的惡性血液病患者的病歷資料，分析患者的臨床特點(diǎn)和IFD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，探討不同SAP策略的療效以及影響IFD復(fù)燃的危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)果:入組164例患者，中位隨訪180天，40例出現(xiàn)IFD復(fù)燃，其中121例(73.78％，121/164)進(jìn)行SAP的患者復(fù)燃20例，復(fù)燃率為16.5％(20/121),43例未進(jìn)行SAP的患者復(fù)燃20例，復(fù)燃率為46.5％(20/43)，

12、兩組復(fù)燃率比較有顯著性差異。121例進(jìn)行SAP的患者，其中58例選用既往抗真菌治療有效的藥物進(jìn)行SAP，8例IFD復(fù)燃，復(fù)燃率13.8％(8/58),63例換用其他廣譜抗真菌藥物進(jìn)行SAP，12例IFD復(fù)燃，復(fù)燃率19.0％(12/63)，兩組復(fù)燃率比較無顯著性差異。異基因HSCT患者IFD復(fù)燃率(25％，15/60)明顯高于化療或自體HSCT患者(8.2％，5/61)。多因素分析二級(jí)預(yù)防下IFD復(fù)燃的危險(xiǎn)因素顯示異基因HSCT為影響I