構(gòu)建預(yù)存HLA-A2抗體動(dòng)物模型并探索有效干預(yù)措施.pdf

1、腎臟移植是終末期腎臟疾病最好的治療方法。隨著免疫抑制藥物廣泛使用，T細(xì)胞介導(dǎo)排斥反應(yīng)顯著降低，但是急、慢性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)在腎臟移植物丟失中起著越來越重要作用。預(yù)存或術(shù)后新生抗人類白細(xì)胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA）抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)已被認(rèn)為是影響移植物長期存活的最重要因素。因此如何有效清除抗HLA抗體及抑制抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)已經(jīng)成為研究和臨床治療的熱點(diǎn)。
　　本研究通過體外合成人源化HLA-A2蛋

2、白，用其構(gòu)建預(yù)存抗HLA-A2抗體動(dòng)物模型并探索有效干預(yù)措施，為臨床脫敏治療奠定基礎(chǔ)。本文共分為三部分：
　　第一部分應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)制備人源化HLA-A2重組蛋白
　　目的：應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)合成人源化HLA-A2胞外段蛋白。
　　方法：利用PCR（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術(shù)從THP-1細(xì)胞中擴(kuò)增HLA-A2胞外結(jié)構(gòu)域基因，并將其連接至PMD19-T載體，構(gòu)建形成PMD-19-H

3、LA-A2克隆載體，通過克隆鑒定和測序分析，利用PCR技術(shù)從PMD-19-HLA-A2中擴(kuò)增HLA-A2胞外段基因，并將其插入pCzn1載體，構(gòu)建形成pCzn1-HLA-A2表達(dá)載體，通過克隆鑒定和測序分析后，將其轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行目的蛋白表達(dá)、純化和鑒定。
　　結(jié)果：經(jīng)過克隆鑒定和測序鑒定，PMD-19-HLA-A2克隆載體和pCzn1-HLA-A2表達(dá)載體構(gòu)建成功；誘導(dǎo)表達(dá)后所獲取蛋白溶液，經(jīng)過鎳柱親和層析純化后，獲得H

4、LA-A2重組蛋白，濃度約為0.49 mg/mL。純化后HLA-A2重組蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，可見一條分子量約為34kD的特異性條帶，與目的蛋白大小相符。
　　結(jié)論：應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)可成功表達(dá)人源化HLA-A2重組蛋白，為下一步建立預(yù)存抗體動(dòng)物模型奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　第二部分應(yīng)用 HLA-A2重組蛋白建立預(yù)存 HLA-A2抗體的BALb/c小鼠模型
　　目的：探討預(yù)存HLA-A2抗體小鼠模型所需免疫原劑量及免疫后小

5、鼠體內(nèi)抗體和淋巴細(xì)胞的變化，為探索治療方案奠定基礎(chǔ)。
　　方法：運(yùn)用不同劑量的HLA-A2重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑混勻后行腹部皮下免疫，使用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測法和流式細(xì)胞檢測法觀察不同時(shí)間點(diǎn)小鼠外周血HLA-A2抗體的變化及小鼠骨髓和脾臟中淋巴細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞及C19+B細(xì)胞和各B細(xì)胞亞群變化。
　　結(jié)果：200μg和100μg

6、免疫劑量均引起小鼠外周血抗體滴度顯著增加，但兩者之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫后，小鼠脾臟中淋巴細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞及C19+B細(xì)胞比例逐漸升高，于第4周時(shí)達(dá)到頂峰；骨髓中淋巴細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞及C19+B細(xì)胞比例逐漸升高，于第2周時(shí)達(dá)到頂峰；骨髓和脾臟中分別以前/祖 B細(xì)胞及記憶性B細(xì)胞亞群變化最明顯。
　　結(jié)論：100μg作為免疫劑量于4周時(shí)可以有效建立預(yù)存HLA-A2抗體BALb/c小鼠模型，并成功觀察到免疫后小鼠骨

7、髓和脾臟中淋巴細(xì)胞亞群變化規(guī)律，為下一步探索清除預(yù)存抗體奠定理論基礎(chǔ)。
　　第三部分清除高致敏小鼠體內(nèi)預(yù)存HLA-A2抗體的研究
　　目的：研究不同治療方法對預(yù)存HLA-A2抗體的BALb/c小鼠外周血中抗體及脾臟和骨髓中淋巴細(xì)胞的影響。
　　方法：運(yùn)用已構(gòu)建預(yù)存HLA-A2抗體的BALb/c小鼠模型，分別使用ELISA法和流式細(xì)胞儀檢測藥物治療后小鼠外周血中HLA-A2抗體及脾臟、骨髓中淋巴細(xì)胞亞群的變化；采用磁珠分

8、選小鼠脾臟和骨髓中CD138+漿細(xì)胞，并運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, Real Time PCR)技術(shù)檢測硼替佐咪治療后CD138+漿細(xì)胞的相關(guān)因子相對表達(dá)量變化。
　　結(jié)果：硼替佐咪單劑量治療后，骨髓中CD19+B細(xì)胞和CD138+漿細(xì)胞顯著下降，其以CD138+漿細(xì)胞最明顯，且骨髓中前/祖B細(xì)胞也顯著降低，3天后開始緩慢恢復(fù)，7天時(shí)恢復(fù)正

9、常；骨髓和脾臟中CD138+漿細(xì)胞的促凋亡因子Chop相對表達(dá)量顯著增加。硼替佐咪短期治療后，骨髓和脾臟中淋巴細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞及長期/短期存活漿細(xì)胞均顯著低于利妥昔單抗治療組，而CD19+B細(xì)胞高于利妥昔單抗治療組；其降低HLA-A2抗體的幅度雖強(qiáng)于利妥昔單抗治療組，但是仍維持較高水平。采用硼替佐咪長期連續(xù)治療后，骨髓淋巴細(xì)胞和CD138+漿細(xì)胞下降幅度大于CD19+B細(xì)胞，且HLA-A2抗體也顯著下降，均顯著低于對照組，但是治