慢病毒系統(tǒng)HBV基因可調(diào)控表達(dá)動物模型的構(gòu)建.pdf

1、乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前，全世界大約有3.5億人感染乙肝病毒，我國約有0.3億人患有乙型肝炎，有很大一部分患者并發(fā)肝硬化及原發(fā)性肝癌。我國是乙肝高流行區(qū)，每年新發(fā)病例約200萬，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)近萬億元。乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒，僅感染靈長類動物及少數(shù)其它物種。經(jīng)過近半個世紀(jì)的研究，乙型肝炎至今仍然沒有被攻克，其原因主要是免疫耐受會造成HBV感染的慢性化，同時免疫

2、耐受也是HBV持續(xù)感染的重要因素。因此，深入了解乙肝病毒免疫耐受的形成機(jī)制、弄清維持免疫耐受的分子基礎(chǔ)及其特征，這是目前攻克乙型病毒性肝炎的重要研究方向。
　　研究乙肝病毒免疫耐受形成機(jī)制、弄清維持耐受的細(xì)胞學(xué)特征和分子機(jī)制需要打破動物模型造成的瓶頸。但迄今為止，可以用來研究乙型肝炎病毒的動物模型主要有黑猩猩、小鼠、土撥鼠、鴨等動物，它們由于自身局限性及穩(wěn)定性而不適合作為常規(guī)的實驗動物模型;更為重要的是:上述動物模型中乙型肝炎病毒

3、DNA在建模初期就已穩(wěn)定的整合到動物肝細(xì)胞的基因組，形成了病毒與宿主細(xì)胞靜態(tài)相容的結(jié)果，因此不能反映病毒侵染過程中細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的過程，更無法達(dá)到對免疫耐受形成前后的差異性研究。因此我們選用四環(huán)素調(diào)控的慢病毒系統(tǒng)來構(gòu)建乙肝動物模型并實現(xiàn)乙肝病毒基因在動物體內(nèi)的可調(diào)控表達(dá)，通過人為的控制來研究不同發(fā)育時期及不同免疫狀態(tài)下動物體內(nèi)的整體變化情況，以此來對形成免疫耐受前后的體內(nèi)狀態(tài)進(jìn)行研究，預(yù)期找出免疫系統(tǒng)的差異性如特異性的分子或者靶點的差異

4、，找到打破免疫耐受的突破口。這對于揭示乙肝病毒特異免疫耐受的形成機(jī)制、弄清維持耐受的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)及特征，將會產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
　　在實驗室之前的工作中，已經(jīng)構(gòu)建了含有乙肝病毒各個基因(X，P，C，preC-C，S，preS2-S，PreS1-S2-S)的可誘導(dǎo)表達(dá)載體質(zhì)粒系統(tǒng)，本研究中將載體利用慢病毒包裝細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞分別獲得含有調(diào)控質(zhì)粒pLVX-Tet-On和表達(dá)質(zhì)粒pLVX-X及pLVX-LS的病毒顆粒，獲得的病毒

5、滴度達(dá)到可108LPs/mL。將包裝獲得的病毒等量混合后進(jìn)行小鼠睪丸注射，每只雄性小鼠的左右側(cè)睪丸內(nèi)各注射約10μL的病毒，注射后與母鼠合籠，母鼠經(jīng)過懷孕、分娩生產(chǎn)獲得子代F0代小鼠。提取F0代小鼠的基因組，通過southern-blot和反向PCR的方法對子代小鼠基因組內(nèi)目的基因的整合情況進(jìn)行研究分析。經(jīng)過鑒定后對其中含有四環(huán)素調(diào)控基因及乙肝病毒部分基因的小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。誘導(dǎo)72h后提取其肝臟組織的蛋白質(zhì)進(jìn)行western-

6、blot驗證及其對其肝臟組織、腎臟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。檢測目的基因的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:本實驗共獲得F0代小鼠共96只，通過Southern-blot和反向PCR的方法對F0代小鼠基因組的分析，在所獲得的F0代小鼠中，四環(huán)素調(diào)控基因陽性小鼠共14只，陽性率為14.58％，乙肝病毒X組小鼠49只，陽性小鼠5只，陽性率為10.20％。將經(jīng)過鑒定后的小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)，在小鼠飲水中加以濃度為1.5mg/mL的強(qiáng)力霉素(DOX)進(jìn)行