TSGL-Ig在肝缺血再灌注損傷中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　在器官獲得，器官移植，器官部分切除，創(chuàng)傷或休克過(guò)程中，缺血再灌注損傷(IRI)所引起的局部無(wú)菌性炎癥反應(yīng)是一個(gè)先天性免疫的必然標(biāo)志性事件。在移植后的早期階段缺血再灌注損傷常會(huì)導(dǎo)致肝臟失去功能或肝臟功能障礙，并可能導(dǎo)致急性和慢性排斥反應(yīng)事件的發(fā)生率增加。此外，由于邊緣性的肝臟受到缺血再灌注損傷尤其明顯和嚴(yán)重，缺血再灌注損傷是造成供肝短缺的情況的重要因素。肝臟內(nèi)皮細(xì)胞(LECs)是肝血竇的血管壁的重要組成。肝臟內(nèi)皮細(xì)胞在控

2、制血管穩(wěn)態(tài)、血管炎癥、血管張力，和血管清除毒物方面發(fā)揮著重要的保護(hù)性的作用。在肝臟低溫保存的過(guò)程中，肝內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷屬于肝臟缺血再灌注損傷的一部分，可以引起移植物微循環(huán)不暢，粘附分子的表達(dá)上調(diào)，氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，進(jìn)一步放大和加強(qiáng)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和損傷作用，進(jìn)而引起肝細(xì)胞壞死。選擇素家族是表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，血小板，白細(xì)胞上的凝集素域糖蛋白，在缺血再灌注損傷初始發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮介導(dǎo)初始趨化、介導(dǎo)白細(xì)胞聚集，以及白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附運(yùn)動(dòng)的作用

3、。在細(xì)胞瀑布樣粘附級(jí)聯(lián)過(guò)程中，P-選擇素糖蛋白-1(PSGL-1，CD162)是P-選擇素唯一已知的高親和力配體。為了進(jìn)一步了解研究粘附素分子拮抗劑在肝臟缺血再灌注損傷引起的炎癥和細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)中的作用，我們構(gòu)建了一個(gè)新的可溶性重組融合抗體，即“TSGL-Ig”，其中“T”的意思為“tandem”，就像馬車并排的兩匹馬一樣，有雙重的PSGL-1結(jié)合位點(diǎn)。已經(jīng)有大量的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究表明，相較于先前的重組PSGL-Ig，該TSGL-

4、Ig被賦予了更高的與選擇素結(jié)合的能力，作為競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑拮抗白細(xì)胞與選擇素的結(jié)合。氧化應(yīng)激引起的活性氧(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生是肝臟缺血再灌注損傷過(guò)程中肝細(xì)胞損傷關(guān)鍵性的病理生理因素。Keap1-Nrf2-AREs信號(hào)通路在處理過(guò)量的活性氧的生產(chǎn)，以及維持細(xì)胞的氧化還原平衡及代謝發(fā)揮不可缺少的作用。因此，本研究試圖闡明缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞受損的分子機(jī)制，并為TSGL-Ig在肝移植中的使用并提高患者預(yù)后提供實(shí)現(xiàn)可能的依據(jù)。

5、>　　目的:
　　本研究旨在通過(guò)模擬臨床相關(guān)的小鼠原位肝移植模型來(lái)檢驗(yàn)在肝移植供肝被長(zhǎng)時(shí)間冷保存過(guò)程中TSGL-Ig在減少肝缺血再灌注損傷中的療效和機(jī)制。實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)TSGL-Ig會(huì)黏附到內(nèi)皮細(xì)胞的選擇素上，并在缺血再灌注損傷減少中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們想知道TSGL-Ig是否通過(guò)引起內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2蛋白活化增加并進(jìn)入細(xì)胞核，并引起下游抗氧化應(yīng)激基因激活來(lái)發(fā)揮維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。我們?cè)O(shè)想TSGL-Ig在小鼠肝移植模型中是通過(guò)粘附于內(nèi)皮細(xì)

6、胞上的選擇素引起Keap1-Nrf2-AREs通路依賴的途徑來(lái)減少來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，減少細(xì)胞損傷，并以此作為提高肝移植患者的預(yù)后的切實(shí)有效治療方法。
　　方法:
　　1.動(dòng)物。8-12周雄性C57BL/6野生型小鼠(WT)及C57BL/6野生型小鼠背景下肝臟Nrf2基因條件性敲除小鼠（基因敲除檢測(cè)至少十二代以上）。
　　2.原位肝移植模型。從WT或Nrf2 KO小鼠取得的肝臟被存儲(chǔ)在20小時(shí)4℃UW液中在植入同種受體之前

7、。三組WT受體在肝切除時(shí)和再灌注之前接受TSGL-Ig，rPSGL-Ig，或?qū)φ彰庖咔虻鞍滋幚怼?br>　　3.熱缺血再灌注損傷模型。在小鼠肝節(jié)段70％熱缺血再灌注損傷模型。
　　4.肝細(xì)胞功能檢測(cè)。測(cè)定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，以評(píng)估肝臟缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度。
　　5.組織病理學(xué)。肝臟標(biāo)本(4μm)，用蘇木精和伊紅染色(H&E)，雙盲法分析肝臟的結(jié)構(gòu)損傷情況。
　　6.髓過(guò)氧化物酶活性測(cè)定。髓過(guò)氧化物酶(

8、MPO)是作為中性粒細(xì)胞在肝臟中積累的指標(biāo)。
　　7.熒光定量PCR。用PCR進(jìn)行肝臟細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)情況分析，以及檢測(cè)Nrf2下游基因的表達(dá)狀態(tài)。
　　8.Western blot。用來(lái)分析肝移植模型中Nrf2蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)情況。
　　9.細(xì)胞培養(yǎng)。小鼠原代細(xì)胞提取后培養(yǎng)在完全DMEM培養(yǎng)基中。
　　10.乳酸脫氫酶/丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶釋放試驗(yàn)。測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶

9、釋的含量，來(lái)測(cè)定培養(yǎng)原代肝細(xì)胞的損傷水平。
　　11.統(tǒng)計(jì)分析。所有值都表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的形式。p＜0.05被認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.TSGL-Ig提高了提高小鼠原位肝移植后的生存率，并且改善和減少了肝缺血再灌注損傷。首先，我們發(fā)現(xiàn)TSGL-Ig處理過(guò)的小鼠接受同種原位肝移植術(shù)后，比對(duì)照免疫球蛋白處理組的生存率明顯要高，超過(guò)90％的TSGL-Ig處理組小鼠在接受移植后14天仍然存活，對(duì)

10、照免疫球蛋白處理組的存活率不到TSGL-Ig處理組的一半。隨后，我們用血清學(xué)分析移植受體肝細(xì)胞功能，H&E染色觀察肝組織病理切片結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TSGL-Ig處理組的肝臟保護(hù)程度要明顯優(yōu)于對(duì)照組。
　　2.在原位肝移植模型中TSGL-Ig抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與TSGL-Ig顯著降低肝移植模型中缺血過(guò)程中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集。髓過(guò)氧化物酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)與免疫組化的數(shù)據(jù)一致，TSGL-Ig組的中性粒細(xì)胞活動(dòng)降低。

11、>　　3.TSGL-Ig抑制缺血再灌注介導(dǎo)的肝細(xì)胞因子及其趨化因子表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果提示移植6小時(shí)后，相對(duì)于對(duì)照組免疫球蛋白處理組，TSGL-Ig處理組的中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞源性炎癥趨化因子(CXCL-1，CXCL-10)和細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1β and IFN-β)均被抑制減少。
　　4.TSGL-Ig缺血再灌注引起的肝臟氧化應(yīng)激和細(xì)胞壞死/凋亡。
　　5.TSGL-Ig調(diào)節(jié)缺血再灌注誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞激活。再

12、灌注后損傷急性期P/E選擇素和VCAM-1/ICAM-1的表達(dá)先明顯上升，其后緩慢下降。并且， TSGL-Ig在原位肝移植模型中顯著減少了內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞黏附分子基因的表達(dá)。
　　6.TSGL-Ig通過(guò)Nrf2依賴的通路來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受缺血再灌注損傷。Western Blot實(shí)驗(yàn)證明原位肝移植模型中缺血再灌注損傷會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2表達(dá)增高。TSGL-Ig處理組引起Nrf2相關(guān)的下游靶基因(Trx，GCL，NQO1

13、，and HIF-1α)表達(dá)升高。體外實(shí)驗(yàn)同樣也證實(shí)了這一點(diǎn)。然后我們用Nrf2條件性敲除小鼠來(lái)探究TSGL-Ig的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制并且發(fā)現(xiàn)，Nrf2信號(hào)通路被阻斷后，內(nèi)皮細(xì)胞更易受到氧化應(yīng)激損傷。與野生型小鼠相比，Nrf2條件敲除小鼠的原代內(nèi)皮細(xì)胞雖然經(jīng)過(guò)TSGL-Ig預(yù)處理，并不能起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
　　7.缺血再灌注損傷環(huán)境下，Nrf2通路在TSGL-Ig表現(xiàn)的肝保護(hù)作用過(guò)程中起到了不可缺少的作用。
　　結(jié)論: