microRNA基因單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系研究.pdf

1、目的:肺癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在中國(guó)，其死亡率和發(fā)病率都很高，而生存率卻很低，其中女性5年生存率僅為16.1％。研究表明，血液中存在的一些蛋白質(zhì)等生物大分子可以為肺癌的早診、早治、耐藥反應(yīng)、預(yù)后等結(jié)局事件提供關(guān)鍵信息，從而提高癌癥的早診率和促進(jìn)臨床醫(yī)生給患者制定更有效的治療措施。這些生物大分子一般稱為生物標(biāo)志物。近年來(lái)研究表明，人類血液中的一些小RNA也起到生物標(biāo)志物的作用。mi croRNA是一類非編碼的RNA序列，具有內(nèi)源性

2、、片段小等特點(diǎn)。它們主要通過(guò)與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，使靶mRNA降解或使靶mRNA翻譯終止，從而達(dá)到影響基因正常表達(dá)，使細(xì)胞、機(jī)體出現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)，從而發(fā)揮功能。研究表明，對(duì)于大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的miRNA，單個(gè)miRNA往往可以與幾十個(gè)靶mRNA相結(jié)合，而很多mRNA往往又能與多個(gè)miRNA結(jié)合，受多個(gè)miRNA的干擾。因此，miRNA的作用網(wǎng)絡(luò)是十分巨大的。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA的生物學(xué)作用受自身基因多態(tài)性的調(diào)節(jié)。當(dāng)一個(gè)基因多

3、態(tài)位點(diǎn)位于pri-miRNA或pre-miRNA上時(shí)，可通過(guò)影響Drosha或Dicer酶的作用從而影響成熟miRNA的表達(dá)量。當(dāng)一個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)位于miRNA的5'種子區(qū)域時(shí)，可通過(guò)影響miRNA與靶mRNA的結(jié)合能力影響miRNA的功能發(fā)揮。研究表明，miRNA的差異表達(dá)譜可在很多腫瘤組織中觀察到，且miRNA的高表達(dá)或低表達(dá)常伴有增高的腫瘤危險(xiǎn)度或較差的預(yù)后。位于miRNA關(guān)鍵位點(diǎn)的基因多態(tài)性也可提示腫瘤的危險(xiǎn)度和預(yù)后的好壞。關(guān)于

4、miRNA基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后的關(guān)系研究得還不夠深入、透徹。因此，本研究擬通過(guò)研究miRNA單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系來(lái)研究miRNA在腫瘤中的作用，并通過(guò)構(gòu)建體外細(xì)胞模型來(lái)研究miRNA單核苷酸多態(tài)性在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮作用的機(jī)制，以期對(duì)miRNA在肺癌的作用機(jī)制有一個(gè)更加完善的了解，并為肺癌的治療提供更加精確的方案，提高治療效果，延長(zhǎng)患者壽命和生命質(zhì)量。
　　研究方法:本文綜合meta分析結(jié)果和生物信息學(xué)分析結(jié)果，

5、篩選擬研究的miRNA的基因多態(tài)位點(diǎn)，構(gòu)建隊(duì)列研究多態(tài)位點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌NSCLC預(yù)后的關(guān)系，并通過(guò)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證多態(tài)位點(diǎn)的功能以及可能的靶基因。
　　1、meta分析的材料和方法
　　使用SCIE、PubMed、CBM、CNKI、萬(wàn)方、Google學(xué)術(shù)搜索、引文索引、參考文獻(xiàn)列表索引等在線數(shù)據(jù)庫(kù)或資源，進(jìn)行按關(guān)鍵詞或主題詞進(jìn)行同義詞、近義詞擴(kuò)展檢索，根據(jù)各種排列組合綜合檢索得到所有可能的文獻(xiàn)。通過(guò)標(biāo)題、摘要等的閱讀納入可能

6、相關(guān)的文獻(xiàn)，排除重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)，提取數(shù)據(jù)，使用STATA13.0軟件進(jìn)行meta分析計(jì)算合并后的HR和95％CI，確定是否存在異質(zhì)性，并進(jìn)行相應(yīng)的發(fā)表偏倚分析和敏感性分析，以確定研究的質(zhì)量。
　　2、隊(duì)列研究的材料和方法
　　通過(guò)dbSNP、miRBase、Patrocles、HapMap、viennaRNA等數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件篩選擬研究的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，建立隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證。隊(duì)列研究得到中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的審批通過(guò)

7、，并與每一位患者簽定了知情同意書(shū)。調(diào)查前，制定納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行隊(duì)列的構(gòu)建，納入的所有研究對(duì)象經(jīng)過(guò)病理類型的確認(rèn)，所有調(diào)查人員進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查培訓(xùn)，收集患者的年齡等基線資料和病理類型等臨床信息，同時(shí)采集患者靜脈血，提取DNA，進(jìn)行基因分型。并對(duì)每一個(gè)患者進(jìn)行電話隨訪，每三個(gè)月進(jìn)行電話隨訪一次，直到患者死亡、失訪或隊(duì)列隨訪結(jié)束。通過(guò)沈陽(yáng)市CDC、沈陽(yáng)市公安局、患者病志確定患者死因和死亡日期。收集60例患者的肺癌組織，提取總RNA，使用2

8、-△△CT法計(jì)算不同基因型患者成熟體miRNA的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算不同基因型患者的中位生存時(shí)間(MST)，使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖，并用log-rank法檢驗(yàn)生存時(shí)間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單因素和多因素的COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型計(jì)算粗HR及其95％CI和調(diào)整后的HR及其95％CI，計(jì)算基因多態(tài)性與預(yù)后的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。
　　3、功能學(xué)研究的材料和方法
　　構(gòu)建含miR-149野生等位基因的過(guò)表達(dá)載體、含miR

9、-149 rs2292832突變等位基因的過(guò)表達(dá)載體，慢病毒包裝質(zhì)粒，穩(wěn)轉(zhuǎn)入人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系，得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，使用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，使用CCK-8法檢測(cè)經(jīng)DDP處理的細(xì)胞增殖能力，從而判斷細(xì)胞的藥物敏感性。使用Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到miR-149的靶位點(diǎn)TOP1，使用String軟件進(jìn)行DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1(TOP1)基因的GO分析和KEGG分析，構(gòu)

10、建含TOP13' UTR區(qū)的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)判斷miR-149與TOP1的靶向作用，使用qRT-PCR法檢測(cè)miR-149和TOP1基因的mRNA表達(dá)水平，使用western blot進(jìn)行TOP1蛋白表達(dá)量的檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1、meta分析結(jié)果
　　(1) miR-146a rs2910164與腫瘤預(yù)后的關(guān)系
　　本研究發(fā)現(xiàn)GG基因型與腫瘤總生存率(OS)的關(guān)系主要存在于美國(guó)人群里。我們未觀察到miR-

11、146a的單核苷酸多態(tài)性SNP與全腫瘤的無(wú)病生存率DFS、無(wú)復(fù)發(fā)生存率RFS的關(guān)系。未發(fā)現(xiàn)miR-146a基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌和消化系統(tǒng)腫瘤預(yù)后的關(guān)系。
　　(2) miR-196a2 rs11614913與腫瘤預(yù)后的關(guān)系
　　本研究發(fā)現(xiàn)含C基因型與腫瘤預(yù)后有關(guān)，且提示預(yù)后較差，經(jīng)分層分析結(jié)果顯示，這種關(guān)系存在于亞洲人群、消化系統(tǒng)、非小細(xì)胞肺癌中。而且攜帶有C的基因型與全腫瘤的RFS有關(guān)。未觀察到與DFS的關(guān)系。

12、　　(3) miR-149 rs2292832與腫瘤預(yù)后的關(guān)系
　　本研究發(fā)現(xiàn)C等位基因與全腫瘤OS有關(guān)，且提示預(yù)后良好，隨著C等位基因數(shù)量的增多效應(yīng)增強(qiáng)。經(jīng)分層分析發(fā)現(xiàn)，C等位基因與非小細(xì)胞肺癌OS有關(guān)，卻與消化系統(tǒng)OS無(wú)關(guān)。
　　(4) miR-499 rs3746444與腫瘤預(yù)后的關(guān)系
　　本研究在顯性模型中觀察到miR-499基因多態(tài)性與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，但未在亞洲人群、消化系統(tǒng)腫瘤和非小細(xì)胞肺癌中觀察到miR-

13、499基因多態(tài)性與腫瘤預(yù)后的關(guān)系。
　　(5)發(fā)表偏倚檢驗(yàn)和敏感性分析
　　經(jīng)漏斗圖和Begg檢驗(yàn)，未觀察到研究存在發(fā)表偏倚。經(jīng)敏感性分析，發(fā)現(xiàn)研究結(jié)果穩(wěn)定可靠。
　　2、隊(duì)列研究結(jié)果
　　(1)5個(gè)SNP位點(diǎn)與OS的關(guān)系
　　miR-149 rs2292832的含C基因型與預(yù)后有關(guān)，且提示預(yù)后較好，含有C基因型的患者M(jìn)ST更長(zhǎng)，死亡率較低。未觀察到miR-146a rs2910164、miR-196a2r

14、s11614913、miR-423 rs6505162、miR-608 rs4919510與NSCLC預(yù)后的關(guān)系。
　　(2)5個(gè)SNP位點(diǎn)與OS關(guān)系的分層分析
　　分層分析結(jié)果顯示，在多個(gè)亞組中miR-149基因多態(tài)性與OS的關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在鱗癌患者中觀察到miR-196a2基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后有關(guān)，含C基因型提示肺癌預(yù)后較好。在接受化療和手術(shù)的患者中觀察到miR-608基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后有關(guān)，且含C基因型提示預(yù)后

15、較差。分層分析未觀察到miR-146a和miR-423基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后的關(guān)系。
　　(3)聯(lián)合作用結(jié)果
　　miR-149和miR-196a2在鱗癌患者中存在聯(lián)合效應(yīng)，隨著miR-149和miR-196a2的C等位基因個(gè)數(shù)的增加效應(yīng)增強(qiáng)。miR-149的含C基因型和miR-608的含G基因型的基因的聯(lián)合作用存在于接受化療和手術(shù)的患者中。
　　(4)5個(gè)SNP與肺癌組織中成熟miRNA表達(dá)量的關(guān)系
　　miR-

16、149含C基因型、miR-146a含G基因型、miR-196含C基因型可增加成熟miRNA的表達(dá)量，miR-423和miR-608的基因多態(tài)位點(diǎn)與相應(yīng)成熟miRNA的表達(dá)量無(wú)關(guān)。
　　(5) miR-27a和miR-30c-1基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后的關(guān)系
　　miR-30c-1的含G基因型，miR-27a的含C基因型是肺癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，且提示預(yù)后較差，經(jīng)分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在多個(gè)亞組中兩者與肺癌預(yù)后的關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且

17、兩者具有聯(lián)合作用，含突變等位基因數(shù)量越多，患者預(yù)后越差。
　　3、功能研究結(jié)果
　　(1) miR-149 rs2292832與A549細(xì)胞成熟miRNA表達(dá)量的關(guān)系
　　含C等位基因的細(xì)胞miR-149的表達(dá)量約是含T等位基因的細(xì)胞miR-149的表達(dá)量的1.55倍。
　　(2) miR-149 rs2292832與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的關(guān)系
　　含C等位基因的細(xì)胞增殖能力弱于含T等位基因的細(xì)胞。含C等位基

18、因的細(xì)胞其細(xì)胞周期與含T等位基因的細(xì)胞其細(xì)胞周期比較，存在G1/S阻滯。
　　(3)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果
　　導(dǎo)入TOP1-3' UTR區(qū)和miR-149短片段的細(xì)胞其相對(duì)熒光素酶活性要低于其他三個(gè)對(duì)照組，即導(dǎo)入TOP1-3' UTR區(qū)和NC mimics組，導(dǎo)入TOP1-3' UTR突變體和miR-149 mimics組，導(dǎo)入TOP1-3' UTR區(qū)突變體和NC mimics組。
　　(4) miR-149 r

19、s2292832位點(diǎn)與TOP1基因表達(dá)的關(guān)系
　　miR-149基因多態(tài)性與TOP1基因的mRNA表達(dá)量無(wú)關(guān)，但與TOP1蛋白表達(dá)量水平有關(guān)。含C等位基因的細(xì)胞TOP1蛋白表達(dá)量低于含T等位基因的細(xì)胞。
　　(5) miR-149 rs2292832位點(diǎn)對(duì)順鉑處理敏感的影響
　　含C等位基因的細(xì)胞比含T等位基因細(xì)胞對(duì)0.977ug/ml，62.5ug/ml，125ug/ml，500ug/ml濃度的順鉑處理更敏感，而對(duì)3

20、.906ug/ml和250ug/ml濃度的順鉑處理較不敏感。
　　結(jié)論:miR-149、miR-196a2、miR-608、miR-27a和miR-30c-1基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后有關(guān)，且miR-149、miR-27a和miR-30c-1是肺癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素。 miR-149、miR-196a2的C等位基因具有聯(lián)合作用，可提示肺鱗癌患者的良好預(yù)后。miR-149的C等位基因與miR-608的G等位基因具有聯(lián)合作用，可提示接受化療