miR-99a-5p和miR-639在骨髓增生異常綜合征患者骨髓中的表達及其意義.pdf

1、目的：探究miR-99a-5p和miR-639在骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓細胞中的表達水平情況，并且分析其與患者臨床病理參數的相關性，同時利用miRNA靶基因在線預測軟件等生物信息學方法對兩者的靶基因進行預測及功能分析，探討miR-99a-5p和miR-639在MDS疾病過程中的意義，以期為MDS發(fā)病機制研究及臨床診療工作中提供新的理論依據。
　　方法：首先應用miRNA表達譜芯片結合分層聚類的方法分別對9例MDS患者（

2、5例IPSS低、中危和4例IPSS高?；颊撸┖?例健康對照組骨髓細胞中miR-99a-5p和miR-639的表達情況進行檢測。然后利用實時定量逆轉錄PCR（Real-time PCR）技術在52例初診MDS患者（包括31例IPSS低危和中危1在內的相對低危組患者、21例IPSS中危2和高危在內的相對高危組患者）、18例初診MDS轉急性髓系白血?。ㄒ韵潞喎Q“轉白”）患者及19例健康對照組的骨髓細胞中miR-99a-5p和miR-639的表

3、達水平進行驗證，并分析兩者在MDS不同亞組的表達情況，然后分別探索兩者與包括染色體核型分析、外周血血象（中性粒細胞絕對值、血紅蛋白量及血小板計數）和骨髓原始細胞比例在內的臨床病理參數的相關性，運用Miranda、Targetscan和Microcosm三種靶基因在線分析軟件分別預測miR-99a-5p和miR-639可能的靶基因，取其預測結果的交集，通過進行基因功能富集分析(GO-analysis)和信號轉導通路富集分析(KEGG Pa

4、thwayanalysis)，并進一步結合現(xiàn)有相關的靶基因文獻報道選出最終可能的潛在靶基因。
　　結果：1.miRNA表達譜芯片結合分層聚類結果顯示在MDS患者中有92個miRNA表達顯著上調（比值R≥2）和198個miRNA表達顯著下調（比值R≤0.5）。其中，miR-99a-5p呈現(xiàn)表達水平的上調(R=4.42，p＜0.05)，miR-639表達水平出現(xiàn)下調(R=0.18，p＜0.01)。2.利用Real-time PCR技術

5、在大樣本MDS患者及MDS轉白患者骨髓細胞中分別對miR-99a-5p和miR-639表達水平進行驗證，結果顯示:與健康對照組相比，miR-99a-5p在總MDS樣本骨髓中呈顯著高表達（R=4.69，p=5.05×10-13），與基因芯片的結果一致，其中相對低危組（低危組和中危1組）的表達量是對照組的2.40倍(p=9.61×10-4)，相對高危組（中危2組和高危組）的表達量是對照組的6.66倍(p=2.65×10-8)，MDS轉白組的

6、表達量是對照組的6.35倍(p=5.66×10-6)。miR-639在總MDS樣本骨髓中的表達水平相較健康對照組則呈現(xiàn)顯著下調（R=0.64，p=7.90×10-5），與基因芯片結果一致，其中相對低危組（低危組和中危1組）的表達量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（p=0.46），相對高危組（中危2組和高危組）的表達量是對照組的0.42倍（p=1.06×10-7），MDS轉白組的表達量是對照組的0.41倍(p=1.29×10-7)。
　

7、　3.將miR-99a-5p和miR-639在所有MDS患者（包括MDS轉白患者）中的表達量分別與MDS患者臨床病理參數進行相關性分析結果顯示:患者染色體核型分析情況與miR-99a-5p表達量無明顯差異(異常組:2.89±1.31正常組:2.00±1.93，p=0.12)，外周血血象與其表達量之間無明顯相關（中性粒細胞絕對值:r=-0.252，p=0.094;血紅蛋白量:r=0.016，p=0.913;血小板計數:r=0.241，p=

8、0.107），但骨髓原始細胞比例與其表達量呈正相關（r=0.645，p=1.33×10-6）。而miR-639的表達量與MDS患者染色體核型分析情況呈現(xiàn)相關性（C=0.378，p=0.010），并且miR-639在染色體異常組的表達量相較染色體正常組低（異常組:0.54±0.29正常組:0.79±0.31，p=0.015），外周血血象與其表達量之間同樣無明顯相關（中性粒細胞絕對值:r=0.033，p=0.829;血紅蛋白量:r=-0.0

9、36p=0.809;血小板計數:r=-0.148，p=0.326），骨髓原始細胞比例與其表達量則呈負相關（r=-0.527，p=1.42×10-4）。
　　4.運用Miranda、Targetscan和Microcosm三種靶基因在線分析軟件分別對miR-99a-5p和miR-639的靶基因進行預測并取其結果的交集顯示:miR-99a-5p可能的靶基因12個，而miR-639可能的靶基因4個。miR-99a-5p和miR-639可

10、能靶基因基因功能富集分析和信號轉導通路富集分析結果顯示:miR-99a-5p的靶基因功能主要富集于有機環(huán)化合物、DNA、核酸等的結合和蛋白磷酸酶、轉移酶等的激活及RNA生物合成過程、轉錄過程等的調控(p＜0.05)，信號通路主要富集于白細胞跨內皮轉移信號轉導通路、腫瘤蛋白聚糖信號轉導通路等(p＜0.05)。miR-639的靶基因功能富集于有機環(huán)化合物、特定序列DNA、核酸等的結合和特定序列DNA結合轉錄因子的活性及RNA代謝過程、轉錄過

11、程等的調控(p＜0.05)，尚未得到有關靶基因的相關信號轉導通路。結合miRNA負調控原理及現(xiàn)有關于miR-99a-5p和miR-639預測的靶基因的相關文獻報道得出:miR-99a-5p最終可能潛在的靶基因為ST5，miR-639最終可能潛在的靶基因為POU2F2。
　　結論：1.miR-99a-5p的表達水平與MDS骨髓原始細胞比例呈正相關，高表達的miR-99a-5p可能參與了MDS疾病的發(fā)生發(fā)展過程。
　　2.與正常

12、對照組相比，miR-639在MDS相對低危組（低危組和中危1組）患者骨髓細胞的表達量無明顯差異，而在相對高危組（中危2組和高危組）及轉白組患者骨髓細胞中表達顯著降低;在所有MDS患者（包括MDS轉白患者）中，miR-639的表達水平與骨髓原始細胞比例呈負相關，并且染色體異常組的患者骨髓細胞中miR-639的表達量相對染色體正常組更低。以上提示低表達的miR-639可能參與了MDS疾病的進展。
　　3.miR-99a-5p可能通過靶