特異性Aurora A和Aurora B激酶抑制劑抑APIO-EE-9制食管癌生長的分子機(jī)制研究.pdf

1、食管癌是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率分別位居第六位和第四位，主要病理類型為食管鱗狀細(xì)胞癌，其特性為侵襲性強(qiáng)，臨床進(jìn)展迅速，預(yù)后差，易復(fù)發(fā)。盡管以外科手術(shù)加化療、放療等聯(lián)合治療，五年存活率仍低于20％，治療進(jìn)展緩慢。因此，尋找小分子靶向治療藥物顯得尤為迫切。
　　Aurora激酶是絲氨酸/酪氨酸蛋白家族的成員，是調(diào)控有絲分裂的重要激酶，近年來被作為癌癥治療的熱門靶點(diǎn)。Aurora激酶在紡錘體組裝、中心體的成熟和分離以及染色體

2、分化等有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用。Aurora激酶的過表達(dá)導(dǎo)致有絲分裂異常，從而使腫瘤更容易發(fā)生。在人類的多種腫瘤中都檢測到Aurora激酶的過表達(dá)。目前報道，Aurora A激酶家族包括三個成員，Aurora A, Aurora B和Aurora C,其功能各不相同。Aurora A激酶位于中心體上，在有絲分裂時Aurora A和紡錘體兩級相連并且參與中心體的組裝和非中心體的紡錘體組裝。Aurora B是染色體乘客復(fù)合物的成分，同時磷

3、酸化組蛋白H3上的絲氨酸10從而控制染色質(zhì)的濃縮。對于Aurora C的報道很少，它在減數(shù)分裂中起重要作用，調(diào)節(jié)精子的形成。研究證實(shí)，Aurora激酶在胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌及膀胱癌等中惡性腫瘤中都存在過表達(dá)，但在食管癌中的作用還沒有明確。作為熱門的抗癌新靶點(diǎn)，許多制藥公司和科研機(jī)構(gòu)致力于Aurora激酶抑制劑的研發(fā)。目前，已有大量的關(guān)于Aurora激酶小分子抑制劑的報道，但是能夠同時抑制有絲分裂重要激酶的Aurora A

4、和Aurora B小分子抑制劑卻寥寥無幾，且毒副作用較高。因此，篩選高效、低毒且同時抑制Aurora A和Aurora B激酶活性的抑制劑顯得尤為重要，且分子機(jī)制的研究為新藥的研發(fā)提供重要的治療策略。
　　在本研究中，我們通過超級計算機(jī)技術(shù)，自主研發(fā)合成特異性的抑制Aurora A和Aurora B的小分子化合物APIO-EE-9。我們發(fā)現(xiàn)此小分子化合物可以抑制食管癌細(xì)胞的錨定非依賴性生長和細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡。通過計算

5、機(jī)模擬技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)此化合物可以同時和Aurora A和Aurora B競爭性的結(jié)合在疏水性的ATP口袋從而發(fā)揮抑制作用。數(shù)據(jù)顯示，APIO-EE-9處理食管癌細(xì)胞可以降低Aurora激酶下游組蛋白 H3絲氨酸10的磷酸化水平。同時，敲除食管癌細(xì)胞中Aurora A和Aurora B的表達(dá)，可以抑制食管癌細(xì)胞的增殖和錨定非依賴性生長。裸鼠移植瘤模型及食管癌人組織來源性腫瘤異種移植（ PDX）模型也證明，APIO-EE-9在沒有影響小鼠體

6、重的同時對食管癌腫瘤的生長有明顯的抑制作用。
　　第一章：APIO-EE-9抑制食管癌細(xì)胞的錨定非依賴生長及細(xì)胞增殖
　　方法：
　　1.利用超級計算機(jī)技術(shù)，自主研發(fā)合成Aurora激酶抑制劑APIO-EE-9。
　　2.檢測APIO-EE-9對正常食管上皮細(xì)胞的毒性。
　　3.利用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測 APIO-EE-9對食管癌細(xì)胞錨定非依賴生長性的影響。
　　4.MTS法檢測APIO-EE-9對

7、食管癌細(xì)胞活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.設(shè)計合成了能夠同時抑制Aurora A和AuroraB激酶活性的化合物APIO-EE-9
　　2. APIO-EE-9對正常食管上皮細(xì)胞Het-1A無明顯的毒性作用
　　MTS結(jié)果顯示表明：不同濃度的APIO-EE-9處理正常食管上皮細(xì)胞Het-1A24小時或者48小時，與對照組相比，492nm處吸光度無明顯降低，提示此化合物對正常食管上皮細(xì)胞沒有明顯毒性。
　　

8、3. APIO-EE-9能夠抑制食管癌細(xì)胞的錨定非依賴性生長
　　軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)顯示：APIO-EE-9能夠呈劑量依賴性的抑制食管癌細(xì)胞系KYSE450、KYSE510和KYSE30的克隆形成。0.25μM APIO-EE-9已經(jīng)顯著抑制了食管癌細(xì)胞的克隆形成（ p<0.01），抑制效率達(dá)到50%以上。5μM APIO-EE-9已經(jīng)完全抑制了克隆形成。
　　4. APIO-EE-9能夠抑制食管癌細(xì)胞的增殖
　　細(xì)胞

9、增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同濃度的APIO-EE-9處理食管癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30后，能夠明顯抑制其細(xì)胞活性。5μM APIO-EE-9處理食管癌細(xì)胞72小時后，492nm處吸光度顯著降低（p<0.01）。
　　第二章：APIO-EE-9誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡
　　方法：
　　1.流式細(xì)胞儀檢測 APIO-EE-9對食管癌細(xì)胞及正常食管上皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　2.不同濃度的APIO-EE-9

10、處理食管癌細(xì)胞，Western blot檢測其對凋亡信號的影響。
　　結(jié)果：
　　1.APIO-EE-9誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡，但對正常食管上皮細(xì)胞沒有影響
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:不同濃度的APIO-EE-9處理正常食管上皮細(xì)胞72小時后，相比對照組，5μM APIO-EE-9僅能誘導(dǎo)8.5%的細(xì)胞凋亡。而用高濃度的APIO-EE-9(5μM)處理食管癌細(xì)胞KYSE45072小時后，結(jié)果顯示能夠誘導(dǎo)83.68%的細(xì)胞

11、凋亡，與對照組相比，差異顯著(p<0.01)。
　　2.APIO-EE-9能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡，并且引起凋亡相關(guān)信號的改變
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，不同濃度的APIO-EE-9處理食管癌細(xì)胞KYSE450， KYSE510和 KYSE30細(xì)胞72小時后，上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白cleaved-PARP, cleaved caspase3和Bax,下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2。
　　第三章：Aurora

12、A和Aurora B在人食管癌組織和食管癌細(xì)胞中高表達(dá)
　　方法：
　　1.Western blot檢測Aurora A和Aurora B在不同的食管癌細(xì)胞系KYSE450、KYSE510和KYSE30中的表達(dá)情況，并且以正常食管上皮細(xì)胞Het-1A作為對照。
　　2.免疫組化法檢測Aurora A和Aurora B在人食管癌組織中的表達(dá)情況。
　　3.APIO-EE-9處理食管癌細(xì)胞24小時后，用Western

13、 blot檢測其對Aurora下游Histone H3的磷酸化水平的影響。
　　4.5μM APIO-EE-9處理食管癌細(xì)胞KYSE4502小時后，用免疫熒光的方法檢測是否出現(xiàn)多個細(xì)胞核。
　　結(jié)果：
　　1.與正常食管上皮細(xì)胞相比，Aurora A和Aurora B在食管癌細(xì)胞系中高表達(dá)
　　Westernblot結(jié)果顯示：與正常的食管上皮細(xì)胞Het-1A相比, Aurora A和Aurora B在不同的食管癌

14、細(xì)胞系中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。
　　2.與食管癌癌旁正常組織相比，Aurora A和Aurora B在食管癌組織中高表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示：相比食管癌癌旁正常組織，Aurora A和Aurora B在人食管癌組織中高表達(dá)，且差異顯著（p<0.01）。
　　3.APIO-EE-9以劑量依賴的方式抑制Aurora下游Histone H3的磷酸化水平
　　不同濃度的APIO-EE-9處理食管癌細(xì)胞KYSE450、KYS

15、E510和 KYSE3024小時后，Western blot檢測Aurora下游Histone H3的磷酸化水平。結(jié)果顯示：APIO-EE-9能夠抑制Histone H3的磷酸化水平，并且呈現(xiàn)劑量依賴的方式。
　　4.APIO-EE-9處理食管癌細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可以看到多倍體出現(xiàn)高濃度的APIO-EE-9（5μM)）處理食管癌細(xì)胞KYSE4502小時以后，在熒光顯微鏡下可以觀察到其一個細(xì)胞內(nèi)有兩個或者多個細(xì)胞核，而在對照組細(xì)胞

16、內(nèi)卻沒有此現(xiàn)象。
　　第四章：APIO-EE-9在體外結(jié)合并抑制Aurora A和Aurora B的活性
　　方法：
　　1.利用超級計算機(jī)技術(shù)模擬化合物APIO-EE-9與靶標(biāo)蛋白Aurora A和Aurora B的相互作用。
　　2.體外激酶實(shí)驗(yàn)首先用活化的Aurora A或者Aurora B激酶，以Histone H3.3作為底物，在ATP的催化作用下，檢測化合物APIO-EE-9對Aurora A和Aur

17、ora B激酶活性的影響。
　　3.Aurora A或者Aurora B蛋白激酶ATP競爭抑制實(shí)驗(yàn)。
　　4.化合物APIO-EE-9蛋白下拉實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.APIO-EE-9與Aurora A或者Aurora B蛋白的ATP結(jié)合區(qū)域相結(jié)合
　　超級計算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)證明：小分子化合物APIO-EE-9與Aurora A或者Aurora B的ATP結(jié)合口袋存在相互作用，能與這一結(jié)構(gòu)結(jié)合形成復(fù)合物。<

18、br>　　2.APIO-EE-9體外抑制Aurora A或者Aurora B激酶活性
　　體外激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：APIO-EE-9對Aurora A或者Aurora B激酶活性抑制效果顯著。這一結(jié)果說明，APIO-EE-9確實(shí)能能夠抑制了Aurora A或者Aurora B激酶活性。
　　3.APIO-EE-9與Aurora A或者Aurora B蛋白激酶的ATP結(jié)合區(qū)域相互結(jié)合，同時競爭性的抑制ATP與Aurora A或者

19、Aurora B的結(jié)合
　　結(jié)果顯示：小分子化合物APIO-EE-9作用于Aurora A或Aurora B的ATP結(jié)合口袋，并劑量依賴性競爭抑制ATP與Aurora A或者Aurora B的結(jié)合。
　　4.APIO-EE-9與Aurora A或者Aurora B蛋白在細(xì)胞水平結(jié)合
　　Pull down實(shí)驗(yàn)證明：小分子化合物APIO-EE-9能與Aurora A或者Aurora B相互作用，形成復(fù)合物。
　　第

20、五章：下調(diào)Aurora A的表達(dá)能夠抑制食管癌細(xì)胞的克隆形成和細(xì)胞增殖，同時促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡
　　方法：
　　1.利用針對Aurora A的shRNA,包裝出逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染食管癌細(xì)胞KYSE450和KYSE510，從而下調(diào)Aurora A的表達(dá)。Western Blot檢測不同的shRNA對Aurora A下調(diào)的效果，以?-actin作為上樣對照。
　　2.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)Aurora A的表達(dá)后對食管

21、癌細(xì)胞克隆形成的影響。
　　3.MTS檢測下調(diào)Aurora A的表達(dá)后，對食管癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測下調(diào)Aurora A的表達(dá)后，對食管癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　5.Western Blot檢測下調(diào)Aurora A的表達(dá)后,對食管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白以及Aurora下游Histone H3磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.用shAurora A＃1和shAurora A＃2包裝的逆

22、轉(zhuǎn)錄病毒成功下調(diào)食管癌細(xì)胞KYSE450和KYSE510中的Aurora A表達(dá)
　　Western Blot結(jié)果顯示：用shAurora A＃1和shAurora A＃2包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KYSE450和KYSE510細(xì)胞系，Aurora A的表達(dá)水平與對照組相比明顯下降，以?-actin作為上樣對照。
　　2.shAurora AKYSE450和KYSE510細(xì)胞組克隆形成數(shù)明顯少于shmockKYSE450和KYSE

23、510細(xì)胞組
　　軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：下調(diào)Aurora A的表達(dá)后，shAurora A＃1和shAurora A＃2細(xì)胞組能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞KYSE450和KYSE510的錨定非依賴性生長，跟shmock細(xì)胞組相比，克隆數(shù)目明顯減少（p<0.01）。
　　3.下調(diào)Aurora A的表達(dá)水平，能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力
　　MTS結(jié)果顯示：下調(diào)Aurora A的表達(dá)后，shAurora A＃1和shA

24、urora A＃2細(xì)胞組能夠顯著抑制試管癌KYSE450和KYSE510的增殖（p<0.01）
　　4.下調(diào)Aurora A的表達(dá)水平，能夠明顯促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：下調(diào)Aurora A的表達(dá)水平后，shAurora A＃1和shAurora A＃2細(xì)胞組分別能夠引起KYSE450細(xì)胞系18%和10%的細(xì)胞凋亡，而引起shMock的細(xì)胞凋亡只有1%（p<0.01）；shAurora A＃1和shA

25、urora A＃2細(xì)胞組分別能夠引起KYSE510細(xì)胞系9%和12%的細(xì)胞凋亡，而引起shMock的細(xì)胞凋亡只有2%（p<0.01）。
　　5.下調(diào)Aurora A的表達(dá)水平，顯著增加了凋亡相關(guān)信號cleaved PARP, cleaved caspase3及Bax的表達(dá)水平，同時顯著抑制了Aurora下游信號分子Histone H3的磷酸化水平
　　Western Blot結(jié)果顯示：與shMock細(xì)胞組相比，shAuror

26、a A＃1和shAurora A＃2細(xì)胞組分別在 KYSE450和 KYSE510細(xì)胞系中顯著增加了促凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP,cleavedcaspase3以及BAX的表達(dá)水平。同時，下調(diào)Aurora A的表達(dá)水平后，顯著抑制了Aurora下游信號分子Histone H3的磷酸化水平。
　　第六章：下調(diào)Aurora B的表達(dá)能夠抑制食管癌細(xì)胞的克隆形成和細(xì)胞增殖，同時促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡
　　方法：
　　

27、1.利用針對Aurora B的shRNA,包裝出逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染食管癌細(xì)胞KYSE450和KYSE510，從而下調(diào)Aurora B的表達(dá)。Western Blot檢測不同的shRNA對Aurora B下調(diào)的效果，以?-actin作為上樣對照。
　　2.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)Aurora B的表達(dá)后對食管癌細(xì)胞克隆形成的影響。
　　3.MTS檢測下調(diào)Aurora B的表達(dá)后，對食管癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4.流式

28、細(xì)胞儀檢測下調(diào)Aurora B的表達(dá)后，對食管癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　5.Western Blot檢測下調(diào)Aurora B的表達(dá)后,對食管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白以及Aurora下游Histone H3磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.用shAurora B＃1和shAurora B＃2包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒成功下調(diào)食管癌細(xì)胞KYSE450和KYSE510中的Aurora B表達(dá)
　　Western Blot結(jié)果顯示：

29、用shAurora B＃1和shAurora B＃2包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KYSE450和KYSE510細(xì)胞系，Aurora B的表達(dá)水平與對照組相比明顯下降，以?-actin作為上樣對照。
　　2.shAurora BKYSE450和KYSE510細(xì)胞組克隆形成數(shù)明顯少于shmockKYSE450和KYSE510細(xì)胞組
　　軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：下調(diào)Aurora B的表達(dá)后，shAurora B＃1和shAurora

30、B＃2細(xì)胞組能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞KYSE450和KYSE510的錨定非依賴性生長，跟shmock細(xì)胞組相比，克隆數(shù)目明顯減少（p<0.01）。
　　3.下調(diào)Aurora B的表達(dá)水平，能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力
　　MTS結(jié)果顯示：下調(diào)Aurora B的表達(dá)后，shAurora B＃1和shAurora B＃2細(xì)胞組能夠顯著抑制試管癌KYSE450和KYSE510的增殖（p<0.01）
　　4.下調(diào)Aurora

31、 B的表達(dá)水平，能夠明顯促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：下調(diào)Aurora B的表達(dá)水平后，shAurora B＃1和shAurora B＃2細(xì)胞組分別能夠引起KYSE450細(xì)胞系88%和85%的細(xì)胞凋亡，而引起shMock的細(xì)胞凋亡只有16%（p<0.01）；shAurora A＃1和shAurora A＃2細(xì)胞組分別能夠引起KYSE510細(xì)胞系22%和15%的細(xì)胞凋亡，而引起shMock的細(xì)胞凋亡只有6%（p<

32、0.01）。
　　5.下調(diào)AuroraB的表達(dá)水平，顯著增加了凋亡相關(guān)信號cleaved PARP, cleaved caspase3及Bax的表達(dá)水平，同時顯著抑制了Aurora下游信號分子Histone H3的磷酸化水平
　　Western Blot結(jié)果顯示：與shMock細(xì)胞組相比，shAuroraB＃1和shAuroraB＃2細(xì)胞組分別在 KYSE450和 KYSE510細(xì)胞系中顯著增加了促凋亡相關(guān)蛋白cleaved

33、 PARP和cleavedcaspase表達(dá)水平。同時，下調(diào)Aurora B的表達(dá)水平后，顯著抑制了Aurora下游信號分子Histone H3的磷酸化水平以及抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)。
　　第七章：下調(diào)AuroraA和AuroraB的表達(dá)水平，顯著抑制了食管癌細(xì)胞體內(nèi)腫瘤生長
　　方法：
　　1.利用下調(diào)Aurora A或者Aurora B的食管癌細(xì)胞株KYSE450裸鼠移植瘤模型檢測下調(diào)Aurora A和Au

34、rora B的表達(dá)水平后對腫瘤生長抑制的作用。
　　2.免疫組織化學(xué)檢測下調(diào)Aurora A和Aurora B的表達(dá)水平后對裸鼠異種移植瘤腫瘤組織Histone H3的磷酸化水平，凋亡相關(guān)標(biāo)志BAX及增殖標(biāo)志Ki-67水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.下調(diào)Aurora A和Aurora B的表達(dá)水平后,顯著抑制了細(xì)胞株KYSE450裸鼠移植瘤生長
　　裸鼠移植瘤動物模型結(jié)果顯示：下調(diào)Aurora A和Aurora

35、 B的表達(dá)水平后，腫瘤的體積隨著天數(shù)的增長明顯受到抑制，且差異顯著（p<0.01）。
　　2.下調(diào)Aurora A和Aurora B的表達(dá)水平后，抑制了Histone H3的磷酸化水平及增殖指標(biāo)Ki-67，促進(jìn)了凋亡相關(guān)標(biāo)志BAX的增多
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與shMock組相比較，下調(diào)Aurora A和Aurora B的表達(dá)水平后，增殖標(biāo)志Ki-67表達(dá)水平顯著降低（p<0.01）；Aurora下游信號分子Histon

36、e H3的磷酸化水平受到顯著抑制（p<0.01），同時，凋亡標(biāo)志BAX顯著增多（p<0.01）。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Aurora A和Aurora B在腫瘤的發(fā)生中起著重要的作用，下調(diào)其水平就可以抑制腫瘤的發(fā)生。
　　第八章：APIO-EE-9抑制食管癌人組織來源的移植瘤生長
　　方法：
　　1.通過人源性腫瘤組織異體移植模型（ PDX）驗(yàn)證APIO-EE-9對食管癌組織的生長抑制作用。
　　2.免疫組織化學(xué)檢測 PD

37、X模型中腫瘤組織的相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.在PDX模型中，APIO-EE-9能夠顯著抑制食管癌組織質(zhì)量和體積的增長
　　PDX動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：荷瘤小鼠隨著APIO-EE-9給藥時間增長，腫瘤體積明顯小于安慰劑對照組（p<0.05）,且小鼠的體重并沒有隨著APIO-EE-9的給藥而明顯降低。給藥6周以后我們發(fā)現(xiàn)，低劑量組（40mg/kg）即能夠明顯降低腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積（ p<0.05），APO-EE-

38、9高劑量組（200mg/kg）對腫瘤生長抑制與低劑量組無明顯差異。
　　2.APIO-EE-9體內(nèi)抑制增殖指標(biāo)Ki-67，且抑制Histone H3的磷酸化
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與對照組相比較，APIO-EE-9治療后的腫瘤組織中， Ki-67,p-Histone H3的表達(dá)水平均受到抑制，cleaved caspase3的表達(dá)水平增高，與對照組相比差異明顯（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.APIO-

39、EE-9作為本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)合成的新型化合物，通過計算機(jī)模擬、體外水平、細(xì)胞水平以及體內(nèi)水平的研究結(jié)果證實(shí)：APIO-EE-9直接作用于Aurora的ATP結(jié)合區(qū)域上，與Aurora結(jié)合，并通過ATP競爭的方式抑制其異常激活，繼而抑制其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終抑制食管癌細(xì)胞的生長和增殖。
　　2.食管癌細(xì)胞株移植瘤及食管癌人組織來源的移植瘤模型結(jié)果與細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。APIO-EE-9能夠有效抑制食管癌細(xì)胞的生長和增殖，且無明