Aurora激酶抑制劑VX-680對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖和凋亡影響的實驗研究.pdf

1、背景:膀胱癌在全球惡性腫瘤中位居第九位,其中在男性惡性腫瘤中居第七位,而女性中居第十七位,其中移行細(xì)胞癌(BTCC)占90％以上,給患者家庭和社會帶來沉重的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。雖然在我國膀胱癌發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方發(fā)達(dá)國家,但是近年來,我國部分城市膀胱癌發(fā)病率有增高趨勢,且城市居民膀胱癌死亡率明顯高于農(nóng)村。非肌層浸潤性膀胱癌行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(TUR-BT)后并行膀胱內(nèi)灌注化療或免疫治療后仍容易復(fù)發(fā),易發(fā)展為肌層浸潤性膀胱癌。而肌層浸潤性

2、膀胱癌,根治性手術(shù)難度高、并發(fā)癥多以及輔助性化療和放療效果不佳。所以探索膀胱癌有效治療的新方法一直是腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。
　　 細(xì)胞增殖是高度有組織的時序調(diào)控過程。細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂必須依靠紡錘體檢查點(diǎn)(spindle checkpoint),又稱有絲分裂檢查點(diǎn)(mitotic checkpoint)監(jiān)控紡錘體形態(tài)、染色體著絲點(diǎn)與微管連接及其產(chǎn)生的張力、染色體排列,確保姐妹染色單體精確分離完成有絲分裂。紡錘體檢查點(diǎn)功能缺陷將導(dǎo)致染

3、色單體錯誤分配,產(chǎn)生非整倍體子代細(xì)胞,致使最終腫瘤發(fā)生。有絲分裂缺陷產(chǎn)生非整倍體導(dǎo)致的腫瘤在眾多腫瘤發(fā)生中已得到證實。Aurora蛋白家族是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,在細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)程中起重要作用,它包括Aurora A,Aurora B, Aurora C3種,業(yè)已證明許多實體腫瘤都存在Aurora A的過度表達(dá)。
　　 目前正在開發(fā)的3個小分子Aurora激酶抑制劑(ZM447439,Hesperadin,VX-680)均非

4、針對某一種Aurora激酶的特異性抑制劑。研究提示,VX-680對激酶的抑制作用更有臨床應(yīng)用作用。腫瘤細(xì)胞水平的實驗證實VX-680可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡,能抑制包括乳腺癌、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、頸部腫瘤等眾多腫瘤細(xì)胞增殖。所以Aurora激酶抑制劑將有可能成為腫瘤治療的有力武器。
　　 Aurora激酶抑制劑在治療腫瘤中具有廣闊前景,我們通過體外實驗研究VX-680對人膀胱癌T24細(xì)胞的抑瘤作用,并從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

5、、調(diào)控細(xì)胞分裂和增殖等方面對其作用機(jī)理進(jìn)行較深入的研究,為BTCC的治療提供新的思路。
　　 第一章、人膀胱移行細(xì)胞癌中Aurora A,CyclinD1,CyclinB1和Bcl-2的表達(dá)及其相關(guān)性的研究
　　 目的:探討Aurora A,CyclinD1,CyclinB1和Bcl-2在BTCC中的表達(dá)及其意義
　　 方法:用免疫組化的方法檢測Aurora A,CyclinD1,CyclinB1和Bcl-2在5

6、6例BTCC和15例正常膀胱組織中的表達(dá)情況,并分析其與BTCC臨床病理因素的關(guān)系。
　　 結(jié)果:膀胱癌組織Aurora A陽性率為51.8％(29/56),高于正常膀胱組織的13.3％(2/15),(P＜0.01);CyclinD1陽性率為46.4％(26/56),高于正常膀胱組織的6.7％(1/15),(P＜0.01);CyclinB1陽性率為75.0％(42/56),高于正常膀胱組織的33.3％(5/15),(P＜0.01

7、);Bcl-2的表達(dá)為62.5％(35/56),高于正常膀胱組織的6.7％(1/15),(P＜0.01)。Aurora A,CyclinB1和Bcl-2陽性率與BTCC的病理分級呈正相關(guān),但是CyclinD1隨病理分級增加而陽性率下降。Aurora A陽性率與臨床分期呈正相關(guān),CyclinD1則呈負(fù)相關(guān);CyclinB1和Bcl-2陽性率與臨床分期無關(guān)。Aurora A陽性率與CyclinD1(R=0.508,P＜0.01)、Cycli

8、nB1(R=0.594,P＜0.01)和Bcl-2(R=-0.535,P＜0.01)陽性率明顯相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.BTCC組織中Aurora A、CyclinD1、CyclinB1和Bcl-2的陽性率高于正常膀胱組織。
　　 2.BTCC組織中Aurora A、CyclinD1、CyclinB1和Bcl-2的陽性率高低與BTCC的腫瘤病理分級明顯相關(guān),病理分級與Aurora A、CyclinB1和Bc

9、l-2陽性率呈正相關(guān),與CyclinD1陽性率呈負(fù)相關(guān)。
　　 3.BTCC的腫瘤臨床分期與Aurora A陽性率呈正相關(guān),與CyclinD1陽性率呈負(fù)相關(guān),與CyclinB1和Bcl-2陽性率與臨床分期無關(guān)。
　　 第二章、 Aurora激酶抑制物VX-680對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖和凋亡影響
　　 目的:探討Aurora激酶抑制物VX-680對人膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,即細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響。<

10、br>　　 方法:設(shè)定不同濃度的Aurora激酶抑制物VX-680作用不同時間于T24細(xì)胞,利用MTT法檢測細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測T24細(xì)胞的凋亡指數(shù),Hochest染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果:Aurora激酶抑制物VX-680不同濃度(0nM,100nM,300nM,500nM)作用T24細(xì)胞于四個不同時間(12h,24h,48h,72h),MTT法檢測細(xì)胞的生長抑制率,流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡率,Hochest染色

11、觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,均發(fā)現(xiàn)呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05),分別在72h和500nM時其效應(yīng)最明顯,在72h時VX-680的IC50=761.222nM。MTT法檢測72h時細(xì)胞存活率,VX-680濃度100nM:0.790±0.038,300nM:0.737±0.033,500nM:0.532±0.013,各濃度間均有差異(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡率,72h時VX-680濃度為0nM:(0.493±0.0

12、33)％,100nM:(6.608±0.550)％,300nM:(12.225±1.232)％,500nM:(18.275±4.986)％,各濃度組間兩兩相比差異性顯著(P＜0.01)。Hochest染色可見到不同程度的凋亡細(xì)胞,低劑量VX-680(100nM)處理細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡較少,增加VX-680劑量(500nM),細(xì)胞凋亡明顯增多,并且可見凋亡小體形成。
　　 結(jié)論:
　　 1.VX-680作用于人膀胱癌T24細(xì)

13、胞后,對T24細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用,并且呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系。
　　 2.VX-680作用于人膀胱癌T24細(xì)胞后,明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,凋亡的誘導(dǎo)作用呈顯著劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系。
　　 第三章、 Aurora激酶抑制物VX-680抑制人膀胱癌T24細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制的研究
　　 目的:探討VX-680抑制人膀胱癌T24細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 方法:設(shè)定不同濃度的VX-680作用不

14、同時間于T24細(xì)胞,半定量RT-PCR檢測T24細(xì)胞的Aurora A,CyclinD1,CyclinB1和Bcl-2mRNA的變化,Western blot檢測Aurora A,CyclinD1,CyclinB1和Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:半定量RT-PCR檢測,不同濃度(0nM,100nM,300nM,500nM)VX-680作用不同時間(12h,24h,48h,72h)于T24細(xì)胞后,降低Aurora A、Cyc

15、linD1、CyclinB1和Bcl-2 mRNA表達(dá)比值和其蛋白表達(dá)比值,并呈明顯的時間效應(yīng)關(guān)系和劑量效應(yīng)關(guān)系。不同VX-680濃度作用72h時Aurora A mRNA表達(dá)比值(Aurora A/GAPDH)分別為,0nM組:0.749±0.012,100nM組:0.638±0.014,300nM組:0.272±0.011,500nM組:0.253±0.003,各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);CyclinD1、Cyclin

16、B1和Bcl-2 mRNA表達(dá)比值在72h時也有類似趨勢。Western blot檢測,Aurora A、CyclinD1、CyclinB1和Bcl-2基因在蛋白表達(dá)水平。72h時各濃度組細(xì)胞AuroraA蛋白表達(dá)比值(AuroraA/GAPDH)分別為,0nM組:0.766±0.016,100nM:0.637±0.013,300nM:0.478±0.009,500nM:0.335±0.004,各組間均差異明顯(P＜0.01);Cycl

17、inD1、CyclinB1和Bcl-2 mRNA基因在蛋白表達(dá)比值在72h時也有類似趨勢。但是短時間(12h)作用于T24細(xì)胞時,不同濃度VX-680(0 nM,100 nM,300 nM,500 nM)對Aurora A、CyclinD1、CyclinB1和Bcl-2mRNA表達(dá)比值下降不明顯,各濃度組間均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.VX-680引起的AuroraA、CyclinD1、Cyc