CYLD調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的機制及FADD-RIPK3在隱球菌病中的作用研究.pdf

1、一、研究目的：
　　程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一種可調(diào)控的、細(xì)胞主動的死亡過程，是多細(xì)胞生物維持正常的生長發(fā)育和機體穩(wěn)態(tài)所必需的。凋亡(apoptosis)是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)依賴的PCD，會引起細(xì)胞內(nèi)成份有序地形成“凋亡小體”，然后被周圍細(xì)胞吞噬，是一種快速有效清除死亡細(xì)胞的方式

2、。細(xì)胞程序性壞死(necroptosis or programmed necrosis)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類PCD，由特定因子啟動，按照一定通路和程序發(fā)生，發(fā)生后會造成細(xì)胞破裂，引起周圍組織的炎癥反應(yīng)。迄今證實包括受體相互作用蛋白激酶(receptorinteracting serine/threonine kinase，RIPK)1、RIPK3、混合譜系激酶樣蛋白(mixed lineagekinase like protein，ML

3、KL)、PGAM5和Z-DNA結(jié)合蛋白1(Z-DNA binding protein1，ZBP1)、頭帕腫瘤綜合征蛋白(cylindromatosis，CYLD)等基因參與細(xì)胞程序性壞死調(diào)控。
　　RIPK3屬于RIPK家族，是程序性壞死通路上的關(guān)鍵分子，與RIPK1、MLKL組成復(fù)合物Ⅱb(necrosome)。Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associating death domain protein，F(xiàn)ADD)是凋亡通

4、路中的重要調(diào)控分子，通過與Fas結(jié)合促進凋亡，是復(fù)合物Ⅱa的組成部分。腫瘤抑制因子CYLD是一種特異性去除K63連接泛素鏈的去泛素化酶，通過去泛素化RIPK1調(diào)控程序性壞死。CYLD的D215位點可被caspase-8進行切割，影響CYLD對RIPK1的去泛素化，RIPK1無法向下激活細(xì)胞壞死通路，從而阻斷細(xì)胞死亡。然而，CYLD是否影響壞死通路中其他蛋白，具體作用機制尚未闡述清楚，小鼠在體的結(jié)果未見報道。
　　研究證實FADD和

5、RIPK3參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，包括病毒感染、細(xì)菌感染、心血管疾病、缺血性損傷、動脈粥樣硬化、慢性腸炎、胰腺炎、肝臟損傷等。然而FADD和RIPK3在真菌感染中是否發(fā)揮作用尚不清楚。在主要的真菌感染中，新生隱球菌感染是其中一種對免疫力低下和免疫力正常人群均有致命危險的真菌感染。隱球菌感染后，機體無法產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，免疫治療導(dǎo)致的過度炎癥加劇病程惡化。既往研究提示，隱球菌感染能夠引起巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞死亡，但是這種由隱球菌引起的死亡在

6、宿主對隱球菌免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)方面的作用并不明確。
　　因此，本課題進行以下兩方面研究:研究CYLD的D215A位點突變對凋亡和程序性壞死的影響及其具體機制;采用小鼠經(jīng)鼻吸入隱球菌模型，研究RIPK3和FADD對隱球菌病肺部免疫的調(diào)控。
　　二、研究方法：
　　（一）CYLD及其D215A點突變對程序性死亡的調(diào)節(jié)作用
　　構(gòu)建CYLD點突變小鼠(CyldD215A/D215A)，分離得到原代小鼠皮膚成纖維細(xì)胞(mous

7、e dermal fibroblast，MDF)和骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophage，BMDM)，體外刺激檢測CYLD的D215A點突變對凋亡和程序性壞死的影響，并研究其分子機制。同時，檢測CYLD的D215A點突變對NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)、炎性小體激活的影響，并利用雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎模型、LPS+z

8、VAD誘導(dǎo)的壞死模型和anti-Fas誘導(dǎo)的凋亡模型，在體研究CYLD及其D215A點突變的作用。
　?。ǘ㏑IPK3/FADD在隱球菌感染肺部免疫中的作用研究
　　以隱球菌經(jīng)鼻吸入感染模型為基礎(chǔ)，應(yīng)用Ripk3-/-和Ripk3-/-Fadd-/-小鼠，通過研究感染后小鼠生存率變化、重要臟器菌落負(fù)荷變化，分析上述通路在宿主對隱球菌免疫反應(yīng)的調(diào)控作用，并結(jié)合組織病理、多色流式分析肺部白細(xì)胞類群和細(xì)胞因子分泌變化、肺相關(guān)淋巴

9、結(jié)中樹突狀細(xì)胞功能變化、巨噬細(xì)胞極化和殺傷功能變化及白細(xì)胞亞群凋亡比例變化等深入分析了上述通路發(fā)揮調(diào)控作用的機制。
　　三、結(jié)果：
　　（一）CYLD及其D215A點突變對程序性死亡的調(diào)節(jié)作用
　　MDF和BMDM細(xì)胞中，CYLD敲除抑制凋亡和程序性壞死，CYLD的D215A點突變促進凋亡和程序性壞死。CyldD215A/D215AMDF在腫瘤壞死因子α(tumor necrosisfactorα，TNFα)+Smac

10、凋亡處理時就發(fā)生程序性壞死，免疫熒光顯示存在RIPK3和RIPK1的聚合。免疫沉淀表明CYLD的D215A點突變通過促進RIPK1和RIPK3聚合來促進凋亡和程序性壞死。CYLD的D215A點突變對NF-κB、MAPKs、炎性小體激活的沒有影響。CYLD及其點突變質(zhì)粒在293T中與RIPK1、RIPK3、MLKL均有相互作用，D215A點突變促進RIPK3的磷酸化。同時敲除CYLD并不能使Fadd-/-小鼠存活，CYLD的D215A點突

11、變不影響雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎模型、LPS+zVAD誘導(dǎo)的壞死模型和anti-Fas誘導(dǎo)的凋亡模型。
　　（二）RIPK3/FADD在隱球菌感染肺部免疫中的作用研究
　　本研究發(fā)現(xiàn)，Ripk3-/-和Ripk3-/-Fadd-/-小鼠吸入感染新生隱球菌后，生存時間均明顯縮短。FADD和RIPK3的缺失引起小鼠隱球菌感染后肺部免疫反應(yīng)的失控:肺組織炎性細(xì)胞大量浸潤、肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重;浸潤的白細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主，計數(shù)較野生型

12、(wild type，WT)小鼠明顯上升，同時嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)顯著降低;產(chǎn)生過強的1型T輔助細(xì)胞(Th1)相關(guān)細(xì)胞因子極化，TNFα、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等及干擾素γ(interferonγ，IFNγ)、IL-12等分泌劇烈增加，而IL-4、IL-33分泌大幅減少。FADD/RIPK3缺失引起的過強的免疫反應(yīng)同肺相關(guān)淋巴結(jié)中樹突狀細(xì)胞的過度成熟、激活相關(guān)。最后，通過分析肺白細(xì)胞亞群凋亡比例變化發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD

13、D/RIPK3可能通過參與調(diào)控中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞凋亡及關(guān)鍵細(xì)胞因子表達來維持肺部免疫反應(yīng)平衡。
　　四、結(jié)論：
　　一、本研究首次在原代細(xì)胞中證明CYLD的D215A點突變促進凋亡和程序性壞死的發(fā)生，CYLD的D215A點突變不影響NF-κB、MAPKs通路及炎性小體的激活;CyldD215A/D215A小鼠原代細(xì)胞在體外表現(xiàn)出促進凋亡和壞死的表型，而不影響在體的凋亡和壞死模型的表型，可能是由于CYLD