CD206、CD68基因單核苷酸多態(tài)性及其在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌發(fā)病及預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、背景：
　　肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上第五大致命的惡性腫瘤，惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差，社會(huì)負(fù)擔(dān)沉重。亞洲是HCC重災(zāi)區(qū)，而我國HCC的發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢(shì)。盡管目前HCC基礎(chǔ)和臨床研究取得諸多成果，外科手術(shù)、介入治療、射頻消融等治療方法使很多患者受益，但是HCC起病隱匿、早期癥狀不明顯，晚期HCC十分常見且呈增加趨勢(shì)，這些患者多伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。同時(shí)，手術(shù)后復(fù)發(fā)也是H

2、CC治療的巨大挑戰(zhàn)。因此，尋找更具潛力的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)將有助于HCC早期診斷和有效治療。HCC是炎癥相關(guān)性癌癥的典型代表之一，肝臟中慢性炎癥狀態(tài)（以乙型肝炎病毒（Hepatitis virus B，HBV）感染常見）通過持續(xù)表達(dá)細(xì)胞因子和募集免疫細(xì)胞到肝臟，從而在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮作用。眾所周知，遺傳因素在HCC發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是

3、基因多態(tài)性的主要形式之一，在人群中頻率大于1%。SNP可以很好反映不同個(gè)體間的遺傳差異，還可能調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響不同個(gè)體對(duì)某種疾病的易感性。SNP已被廣泛應(yīng)用于人類各種疾病的研究中，其中腫瘤相關(guān)SNP在個(gè)體對(duì)癌癥易感性中扮演重要角色。
　　巨噬細(xì)胞是腫瘤中浸潤最多的免疫細(xì)胞，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是實(shí)體腫瘤中免疫浸潤物的主要成分。TAMs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)

4、揮的作用已被廣泛研究。巨噬細(xì)胞一般被分為經(jīng)典活化型（M1型巨噬細(xì)胞）和替代活化型（M2型巨噬細(xì)胞），一般認(rèn)為TAMs屬于M2型巨噬細(xì)胞，具有類似M2的標(biāo)志物及促癌功能；但也有研究表明TAMs可以從M2樣巨噬細(xì)胞向M1樣細(xì)胞逆轉(zhuǎn)，具有可逆性。TAMs這種復(fù)雜的生物學(xué)特點(diǎn)給臨床研究和實(shí)踐帶來巨大挑戰(zhàn)。然而，目前TAMs在肝癌發(fā)生發(fā)展中的角色仍未被完全闡明。CD68是重要的巨噬細(xì)胞特異性膜蛋白，也是泛巨噬細(xì)胞可靠的標(biāo)志物。除了多種組織中定居的

5、巨噬細(xì)胞，CD68還表達(dá)于腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞。CD206，又稱巨噬細(xì)胞甘露糖受體（macrophage mannose receptor，MMR）或甘露糖受體C1型（MRC1）是一種具有噬菌和內(nèi)吞作用的模式識(shí)別受體，主要表達(dá)于大部分巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞亞群，通常被用來鑒定M2型巨噬細(xì)胞。目前，CD68和CD206在人類疾病中的結(jié)構(gòu)與功能已被廣泛關(guān)注，但是有關(guān)CD68和CD206的基因多態(tài)性與人類HCC的易感性及預(yù)后是否存在關(guān)聯(lián)、兩者在HCC

6、患者血清中表達(dá)水平尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究從DNA、組織學(xué)、血清學(xué)三個(gè)不同層面比較系統(tǒng)研究了CD68和CD206在HCC中的表達(dá)及意義。
　　目的：
　　本課題分為三個(gè)部分進(jìn)行研究。
　　第一部分：探究CD68和CD206三個(gè)位點(diǎn)（CD68 rs9901675、CD68 rs9901673、CD206 rs941）多態(tài)性及其與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，以期為HCC發(fā)病機(jī)制的研究提供新的切入點(diǎn)。
　　第二部分

7、：探討CD68陽性巨噬細(xì)胞和CD206陽性巨噬細(xì)胞的數(shù)量和分布在HCC癌組織和癌旁組織中有無差異，評(píng)估其預(yù)后價(jià)值。
　　第三部分：初步探討HCC患者和健康對(duì)照者血清中可溶性CD68(a soluble form of sCD68，sCD68)和可溶性CD206(a soluble form of sCD206，sCD206)表達(dá)水平及其對(duì) HCC的診斷及預(yù)后意義，為 HCC個(gè)體化臨床診治和長期隨訪管理提供有效的理論依據(jù)。
　

8、　方法：
　　第一部分：采用病例對(duì)照研究，連續(xù)收集符合條件的原發(fā)性HCC患者311例和健康體檢者415名，采集研究對(duì)象的一般情況、臨床及預(yù)后生存資料，同時(shí)收集全血標(biāo)本、提取基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），檢測(cè)CD68和CD206基因三個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性，分析其與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、臨床表型以及預(yù)后的關(guān)系。
　　第二部分：選擇268例行肝切除手術(shù)HCC患者進(jìn)行回顧性研究。使用免疫組化方法檢測(cè)H

9、CC癌組織和癌旁組織中CD68陽性巨噬細(xì)胞和CD206陽性巨噬細(xì)胞，分析不同部位表達(dá)差異；采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristics curve ROC）評(píng)價(jià)CD68陽性和CD206陽性兩種巨噬細(xì)胞對(duì)HCC的診斷價(jià)值；評(píng)估兩者與HCC患者總體生存期和無瘤生存期的關(guān)系以及兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC預(yù)后價(jià)值。
　　第三部分：從第一部分研究樣本中選取HCC術(shù)前患者123例和HCC術(shù)后患者60例

10、、健康體檢中心健康體檢者60名，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清中sCD68和sCD206水平，分析兩者變化規(guī)律及其與HCC臨床病理特征之間的關(guān)系，初步探討兩者對(duì)HCC的診斷價(jià)值及預(yù)后意義。
　　結(jié)果：
　　第一部分：311例HCC患者和415名健康對(duì)照的SNP分析結(jié)果顯示，CD68 rs9901675多態(tài)性與HCC遺傳易感性有關(guān)（OR=0.409

11、，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為0.206～0.812，P=0.009），該位點(diǎn)三種基因型GG、GA和AA的頻率在HCC病例組為96.46%、3.54%和0%，對(duì)照組為92.53%、6.51%和0.96%，經(jīng)調(diào)整性別年齡后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)；但尚未發(fā)現(xiàn) CD68 rs9901673、CD206 rs941兩個(gè)SNP位點(diǎn)與HCC易感性存在關(guān)聯(lián)(P均＞0.05)。生存分析結(jié)果顯示，CD68

12、 rs9901675是 HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[HR(95%CI)=8.114(1.103～59.675)，P=0.040]，但是該位點(diǎn)多態(tài)性與HCC主要臨床特征之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。
　　第二部分：（1）免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：①CD68陽性和CD206陽性兩種巨噬細(xì)胞在HCC癌旁組織中的表達(dá)量均顯著高于癌組織（P均＜0.05）；②不同年齡、不同血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）水平、是否

13、伴有門脈高壓的HCC患者癌組織中CD68陽性巨噬細(xì)胞表達(dá)量不同（P均＜0.05）；而是否伴門脈高壓或HBV陽性、不同AFP和腫瘤直徑的HCC患者癌旁組織的CD68陽性巨噬細(xì)胞的浸潤密度亦不同（P均＜0.05）；③CD206陽性巨噬細(xì)胞在不同性別、Child-Pugh分級(jí)患者的癌組織中表達(dá)水平不同（P均＜0.05），而是否伴有肝硬化、不同血清總膽紅素和TNM（tumor-nodes-metastasis）分期的患者癌旁組織中表達(dá)強(qiáng)度亦不同

14、（P均＜0.05）。
　?。?）ROC曲線結(jié)果顯示，癌內(nèi)CD68診斷臨界值（cut-off value）設(shè)定為71個(gè)/每高倍視野（high-power fields，HPF），曲線下面積（area under curve，AUC）為0.614，95%CI為0.547～0.678，敏感性52.2%，特異性70.7%，對(duì)HCC診斷有意義（P=0.003）；癌旁CD68最佳臨界值為87個(gè)/每高倍視野（high-power fields，

15、HPF），AUC為0.599，95%CI為0.534～0.661，敏感性49.5%%，特異性70.5%，對(duì)HCC診斷有意義（P=0.008）。
　?。?）Kaplan-Meier法比較生存曲線顯示，癌內(nèi)組織高表達(dá)CD206的HCC患者預(yù)后差，總體生存期（P=0.014）和無瘤生存期（P=0.003）均短于低表達(dá)組患者；而癌旁組織高表達(dá)CD68的HCC患者總體生存時(shí)間（P=0.020）和無瘤生存時(shí)間（P=0.018）則更長。Cox回

16、歸分析結(jié)果顯示，癌旁高表達(dá)的CD68陽性巨噬細(xì)胞是HCC患者總體預(yù)后[HR（95%CI）=0.510（0.311～0.837），P=0.008]和術(shù)后復(fù)發(fā)[HR（95%CI）=0.529（0.299～0.935），P=0.028]的保護(hù)性獨(dú)立預(yù)后因子；而癌內(nèi)高表達(dá)的CD206陽性巨噬細(xì)胞則是HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素：總體生存期[HR（95%CI）=1.792,（1.116～2.879），P=0.016]和無瘤生存期[HR（95%CI

17、）=2.222（1.280～3.856），P=0.005]。
　?。?）聯(lián)合分析癌旁CD68陽性腫瘤巨噬細(xì)胞和HBV的結(jié)果顯示，癌旁CD68陽性巨噬細(xì)胞或癌內(nèi)CD206陽性巨噬細(xì)胞與HBV聯(lián)合分析，HCC患者的無瘤生存期差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），但是聯(lián)合分析CD68陽性巨噬細(xì)胞與HBV對(duì)總生存期無明顯影響（P=0.102）。
　　第三部分：（1）HCC患者手術(shù)前和手術(shù)后血清sCD68和sCD206水平均明顯高于

18、正常對(duì)照組（P均＜0.05），但是術(shù)前與術(shù)后血清sCD68和sCD206水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。同時(shí)，術(shù)前與術(shù)后sCD68/sCD206、術(shù)前sCD68與sCD206、術(shù)后sCD68和sCD206均存在相關(guān)性（P均＜0.05）。
　?。?）進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，兩者與HCC重要臨床特征（HBV、肝硬化、門脈高壓和血清AFP水平）存在密切聯(lián)系（P均＜0.05）。
　?。?）CD68 rs9901675、C

19、D68 rs9901673、CD206 rs941三個(gè)位點(diǎn)的不同基因型的HCC患者血清中sCD68/sCD206水平均無明顯差異（P均＞0.05）。
　?。?）ROC曲線分析結(jié)果表明，當(dāng)術(shù)前血清sCD206為20.52ng/ml時(shí)，可獲得最大的曲線下面積，術(shù)前血清sCD206具有診斷HCC價(jià)值（P=0.032），而術(shù)前血清sCD68則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.174）。
　　（5）生存分析結(jié)果顯示，術(shù)后血清高表達(dá)sCD68、伴有

20、門靜脈癌栓、術(shù)前白蛋白降低、堿性磷酸酶升高、總膽紅素升高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的HCC患者總體生存時(shí)間較短，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），進(jìn)一步Cox回歸分析結(jié)果顯示，術(shù)后血清高表達(dá)sCD68是獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素[HR（95%CI）=8.059（1.007～64.487），P=0.049]。而術(shù)前sCD68和sCD206以及術(shù)后sCD206對(duì)HCC患者預(yù)后未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.

21、CD68 rs9901675多態(tài)性與HCC患病遺傳易感性有關(guān)，該位點(diǎn)G等位基因和GG基因型可能是HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素，也是HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。
　　2.定量分析HCC組織中CD68陽性和CD206陽性巨噬細(xì)胞可以為HCC患者術(shù)后分層管理提供線索，為再馴化HCC微環(huán)境中巨噬細(xì)胞提供新思路新方法。癌旁高表達(dá)的CD68是HCC患者預(yù)后獨(dú)立保護(hù)因子，而癌內(nèi)高表達(dá)的CD206是HCC患者預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。聯(lián)合分析CD68或CD206