樹突狀細(xì)胞亞群及IL-16基因單核苷酸多態(tài)性與Graves病發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景： Graves病(GD)又稱彌漫性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進(jìn)(甲亢)或毒性彌漫性甲狀腺腫，是一種常見的自身免疫性疾病(AITD)。本病的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，然而大量研究已表明，免疫和遺傳機(jī)制在GD的發(fā)病中起著重要的作用。 樹突狀細(xì)胞(DCs)作為體內(nèi)最有效的抗原呈遞細(xì)胞，在免疫反應(yīng)中處于核心調(diào)控地位。研究表明，人類外周血DCs主要分為髓系(myeloiddendriticcell；MDC)和漿細(xì)胞系(pla

2、smacytoiddendriticcell；PDC)兩個(gè)亞群，其中MDC分泌IL-12引起Th1免疫應(yīng)答，而PDC主要引起Th2的免疫應(yīng)答，但也能通過分泌IFN-α引起Th1免疫應(yīng)答。有關(guān)外周血DC及其亞群與SLE、重癥肌無力、哮喘等自身免疫性疾病關(guān)系的研究多有報(bào)道，然而鮮有對(duì)GD研究的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在觀察GD患者外周血細(xì)胞中DCs亞群數(shù)量和功能的變化，尋找優(yōu)勢(shì)DC亞群，并以此為切入點(diǎn)，闡明DC在GD致病機(jī)制中的作用及途徑，為尋找

3、GD免疫干預(yù)治療的靶點(diǎn)以達(dá)到病因根治提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 GD又是一種復(fù)雜的多基因疾病，發(fā)病受遺傳和環(huán)境因素的共同影響。目前研究多基因疾病的主要方法是單核苷酸多態(tài)性(SNP)病例-對(duì)照研究和人群研究。有研究表明，編碼IL-16基因啟動(dòng)子區(qū)-295位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與多種自身免疫病發(fā)病的易感性有關(guān)；而近年的研究亦表明，IL-16作為CD4+T細(xì)胞的趨化因子參與GD的病理過程，但有關(guān)該編碼基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)GD發(fā)病影響的研究尚

4、未見報(bào)道。 本研究擬分析該己知位點(diǎn)和GD發(fā)病的關(guān)系，并通過對(duì)標(biāo)簽SNP(TagSNP)基因型分析，探討基因多態(tài)性的單倍型與GD發(fā)病的關(guān)系。 研究方法： 收集GD患者(n=36)及性別和年齡匹配的健康志愿者(n=21)的靜脈血，利用流式細(xì)胞儀分析外周血樹突狀細(xì)胞及其亞群(PDC和MDC)的頻數(shù)和在PBMC中的比例；利用磁珠分選技術(shù)從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離出MDC(BDCA-1)、PDC(BDCA-4)和健康志愿者的

5、naiveT細(xì)胞，并進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，觀察GD未治療患者外周血DC亞群刺激naiveT細(xì)胞的增殖和分化情況。同時(shí)檢測上述研究對(duì)象及GD治療組患者(n=32)血清Th1/Th2細(xì)胞因子(IFN-γ/IL-4)的水平，評(píng)價(jià)疾病不同時(shí)期血清Th1/Th2細(xì)胞因子的變化情況，及DC亞群和血清Th1/Th2細(xì)胞因子變化之間的關(guān)系。 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)的方法分析了258例GD患者(其中136例伴

6、GD相關(guān)眼病)和208例性別年齡匹配的健康志愿者的IL-16編碼基因tagSNP的基因型和單倍型；分析其與GD及其相關(guān)眼病發(fā)病易感性的關(guān)系。 研究結(jié)果： 外周血樹突狀細(xì)胞的頻數(shù)分析顯示，初發(fā)GD患者體內(nèi)DC亞群(MDC/PDc)出現(xiàn)偏移，表現(xiàn)為PDC增多(0.25±0.18vs0.11±0.07％，p=0.002；4.50±3.52vs2.74±2.06個(gè)/ul,p=0.018)，MDC/PDC的比值下降(3.50±2.

7、22vs4.92±2.85，p=0.042)。體外功能研究顯示，GD患者的PDC誘導(dǎo)naiveT細(xì)胞向Th1分化的能力較健康對(duì)照者顯著增強(qiáng)。檢測混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)上清液細(xì)胞因子的結(jié)果顯示，GD患者PDC組分泌的IFN-α、TNF-α、IL-6均顯著高于健康對(duì)照組(p＜0.05)，提示PDC不僅能通過分泌IFN-α誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答，IFN-α還能協(xié)同IL-6誘導(dǎo)B細(xì)胞向分泌特異性抗體的漿細(xì)胞分化，從而促進(jìn)自身抗體TRAb(TSH受體抗

8、體)的產(chǎn)生。 利用ELISA法檢測血清細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的結(jié)果顯示：GD未治療組的IFN-γ(61.25±41.49pg/ml)水平顯著高于GD治療組和健康對(duì)照組(26.22±11.173pg/mland20.216±16.49pg/ml；p＜0.01)，而GD治療組的IL-4水平(45.37±39.28pg/ml)則高于GD未治療組和健康對(duì)照組(35.84±13.33pg/ml和34.218±9.33pg/ml；p＜

9、0.05)，提示Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在GD發(fā)病初期起重要作用。 對(duì)258例GD患者(136例伴GD眼病)和208例健康志愿者DNA的IL-16編碼基因tagSNP的基因型和單倍型檢測，以及IL-16基因單核苷酸多態(tài)性與GD發(fā)病易感性關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果表明，基因型rs4778889TT和rs1131445TT是GD發(fā)病的易感因素；而rs4778889TT和rs4778641TT則是GD相關(guān)眼病的易感因素。單倍型rs4778889C-r

10、s113445T-rs4778641C對(duì)于GD及其相關(guān)眼病而言是一個(gè)保護(hù)因素。 結(jié)論： 本研究通過分析初發(fā)GD患者外周血樹突狀細(xì)胞及其亞群(PDC和MDC)的頻數(shù)和在PBMC中的比例，以及體外觀察PDC和MDC刺激naiveT細(xì)胞增殖和分化的情況，初步探討了樹突狀細(xì)胞亞群在GD發(fā)病機(jī)制中的作用和途徑。 結(jié)果表明： (1)GD患者外周血PDC增多并通過分泌IFN-α促使naiveT細(xì)胞向Th1分化的能力增強(qiáng)