芒果苷小檗堿鹽在HepG2細胞中調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用研究.pdf

1、天然產(chǎn)物芒果苷(mangiferin，M)作為一種氧雜蒽酮糖苷類化合物在降脂、降糖、減肥、抗炎和抗氧化方面表現(xiàn)出良好效果，天然產(chǎn)物小檗堿(berberine，B)作為一種異喹啉類生物堿在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面也表現(xiàn)出良好藥理活性。本研究首先運用化學方法將M和B通過離子鍵連接形成單一的穩(wěn)定分子，制備新化合物芒果苷小檗堿(mangiferin-b erb erine，MB)鹽，然后對MB鹽在HepG2細胞中調(diào)控糖脂代謝的活性和機制進行了深入研究，

2、并與M或B單獨應用進行了對比。
　　首先利用MTT法檢測了M，B，MB鹽三個化合物的體外毒性，以期為后續(xù)實驗藥物處理濃度的選擇提供參考。接著Western Blot實驗檢測化合物對腺苷酸依賴的蛋白激酶α（AMP-activated protein kinaseα，AMPKα）第172位蘇氨酸(Thr172)和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）第79位絲氨酸(Ser79)磷酸化水平的影響，以試劑

3、盒檢測化合物對肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(camitine palmitoyl transferase1，CPT1)活力的影響。在調(diào)節(jié)糖類代謝方面，通過試劑盒檢測三個化合物對基礎水平以及胰島素刺激的糖消耗的促進作用;通過試劑盒檢測三個化合物對HepG2細胞糖異生的抑制作用，與此對應，通過反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測三個化合物對糖異生關鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(ph

4、osphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）mRNA表達水平的影響。在調(diào)節(jié)脂類代謝方面，首先通過qPCR的方法檢測三個化合物對低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)mRNA表達水平的影響，接著利用油酸(oleic acid，OA)造模，建立HepG2細胞脂肪變性模型，通過

5、油紅O(ORO)染色法以及測定細胞內(nèi)三酰甘油(triglyceride，TG)含量的方法觀察三個化合物降低細胞內(nèi)脂肪的作用，與此對應利用qPCR的方法檢測細胞脂肪合成關鍵轉(zhuǎn)錄因子如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和碳水化合物反應元件結(jié)合蛋白（carbohydrate-responsive element-binding protein

6、，ChREBP）及其靶基因如脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）和固醇輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1）的mRNA表達水平。利用AMPK特異性抑制劑compound C(CC)進行阻斷實驗。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HepG2細胞內(nèi)化合物M對細胞生長的的半數(shù)抑制濃度(IC50)大于400μM，化合物B對HepG2細胞生長的IC50為133.9±10.6μM，化合物

7、MB鹽對HepG2細胞生長的IC50為131.0±9.4μM。
　　結(jié)果還表明三個化合物均能劑量依賴地促進AMPK-α(Thr172)磷酸化、ACC(Ser79)磷酸化并增加CPT1活力，并且這些作用均能被CC預處理所完全阻斷。MB鹽刺激AMPK通路的效果顯著優(yōu)于同等摩爾濃度的M或B單獨應用。在調(diào)節(jié)糖類代謝方面，三個化合物均能促進基礎水平糖消耗和胰島素刺激的糖消耗，且MB鹽的效果明顯優(yōu)于同等摩爾濃度的M或B單獨應用。B和MB鹽能促

8、進細胞乳酸釋放，而M沒有效果。MB鹽中的M部分通過AMPK依賴的方式來促進細胞糖消耗，而其中的B部分通過AMPK非依賴的途徑來促進糖消耗;MB鹽促進細胞糖消耗的作用部分依賴于AMPK，而促進細胞乳酸釋放的作用不依賴于AMPK。另外，MB鹽顯著抑制細胞糖異生，并且其作用也優(yōu)于M或B單用，且該作用依賴于AMPK。MB鹽在抑制糖異生的過程中能夠顯著下調(diào)糖異生關鍵酶PEPCK和G6Pase的mRNA表達水平。在調(diào)節(jié)脂類代謝方面，MB鹽能顯著抑制

9、OA誘導的細胞脂肪變性，降低細胞內(nèi)TG含量，下調(diào)SREBP-1c，ChREBP，F(xiàn)as，SCD1mRNA表達水平，其效果顯著優(yōu)于同等摩爾濃度的M或B單獨應用，且MB鹽的這種作用依賴于AMPK的激活。MB鹽在體外調(diào)控糖脂代謝的活性與同等摩爾濃度的M加B聯(lián)合應用(M+B)相當，但作為穩(wěn)定的單一分子，MB鹽在體內(nèi)可能更易吸收，具有更好的藥代動力學參數(shù)。
　　本研究表明，新化合物MB鹽通過激活AMPK/ACC/CPT1通路以及抑制脂肪合成