焦?fàn)t逸散物有機(jī)提取物對(duì)支氣管上皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：焦?fàn)t逸散物（coke oven emission，COE）是在焦化生產(chǎn)過(guò)程中釋放的主要環(huán)境污染物，除顆粒物外，具有多種致突變和致癌性的多環(huán)芳烴。長(zhǎng)期暴露于COE容易引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生慢性炎癥和腫瘤，而炎癥又可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用不同染毒劑量的焦?fàn)t逸散物有機(jī)提取物作用于16HBE細(xì)胞建立24h和5d細(xì)胞染毒模型。初步探討焦?fàn)t逸散物有機(jī)提取物對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的損傷情況。為后續(xù)COE暴露人群的效應(yīng)性生物標(biāo)志物分析提供依

2、據(jù)和線(xiàn)索。
　　方法：1 COE有機(jī)提取物作用于16HBE細(xì)胞建立24h染毒模型：將人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE接種在含有10％的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，在37℃和5% CO2的條件下傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)70%時(shí)用不同濃度的焦?fàn)t逸散物有機(jī)提取物處理24h，作用濃度依次為5mg/L、10mg/L、20mg/L，胎牛血清濃度為5%。同時(shí)設(shè)置0.1%DMSO的COE溶劑對(duì)照，每個(gè)劑量組均設(shè)置平行樣。2 COE有機(jī)提取物作用于16H

3、BE細(xì)胞5d染毒模型建立：細(xì)胞培養(yǎng)條件、染毒物質(zhì)的劑量與24h模型相同，連續(xù)染毒5d，每次更換新的含COE有機(jī)提取物的培養(yǎng)基，每個(gè)劑量組均設(shè)立平行樣。3應(yīng)用MTT和乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)估COE對(duì)16HBE細(xì)胞的細(xì)胞毒性。4應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)16HBE細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的釋放水平。5應(yīng)用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)16HBE細(xì)胞的DNA損傷情況。6應(yīng)用懸液芯片 Human Th17 Cytokine Panel15-Plex檢測(cè)上清液中IL

4、-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-31、IL-33、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、可溶性細(xì)胞表面分化抗原40配體（sCD40L）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)情況。7應(yīng)用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)IκBα、P-IκBα、P65和P-P65蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：120mg/L COE有機(jī)提取物染毒16HBE細(xì)胞24h后，細(xì)

5、胞存活率為89.38%（P＜0.05），LDH釋放量為147.68%（P＜0.05）。10 mg/L和20 mg/L COE有機(jī)提取物染毒16HBE細(xì)胞5d后，LDH釋放量分別為124.39%和149.64%（P＜0.01）。說(shuō)明 COE有機(jī)提取物可以損傷16HBE細(xì)胞，染毒周期增加，毒性亦增加。2 COE有機(jī)提取物無(wú)論24h染毒還是5d染毒均能檢測(cè)到活性氧的釋放，隨著染毒劑量的增加而逐漸升高（P＜0.01）。在24h染毒的模型中，5m

6、g/L低劑量組的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度相較對(duì)照組增加的倍數(shù)值比在5d模型中低。在24h模型中增加的倍數(shù)是14.47倍，5d模型中為17.85倍。3單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示，細(xì)胞出現(xiàn)DNA損傷。20mg/L COE有機(jī)提取物染毒16HBE細(xì)胞24h后，尾部DNA百分含量增加83.51%（P＜0.01），Olive尾距指標(biāo)增加76.47%（P＜0.05）。20mg/L COE有機(jī)提取物染毒16HBE細(xì)胞5d后，尾部DNA百分含量與對(duì)照組相比較增加8

7、9.28%（P＜0.01），Olive尾距指標(biāo)值增加量為照組的117.07%（P＜0.01）。4 COE有機(jī)提取物染毒16HBE細(xì)胞24h后，IL-10的表達(dá)量分別是1.25±0.54、1.39±0.13和（1.90±0.73） pg/mL，具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系（r=0.98，P＜0.05）。IL-23僅在該模型的中、高劑量組表達(dá)。COE有機(jī)提取物染毒16HBE細(xì)胞5d后，IL-10在各劑量組的表達(dá)量依次為1.71±0.02、1.4

8、9±0.13和（2.82±0.16） pg/mL。IL-1β僅在該模型中表達(dá)。表明 COE有機(jī)提取物影響16HBE細(xì)胞炎性因子的表達(dá)。5 COE有機(jī)提取物染毒24h對(duì)16HBE細(xì)胞中NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響：IκBα蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L COE組下降量分別為對(duì)照組的26%、33%和56%（P＜0.05）。P-IκBα蛋白表達(dá)量在中、高劑量組上升顯著，在10mg/L COE組中的增加量

9、為對(duì)照組的79%（P＜0.05），在20 mg/L COE組的表達(dá)量是對(duì)照組的2.02倍（P＜0.05）。P-P65在10 mg/L COE組的表達(dá)量為對(duì)照組的3.84倍（P＜0.05），在20 mg/L COE處理組，其表達(dá)量為對(duì)照組的6.43倍（P＜0.05）。P65蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：1、IL-23和IL-1β分別反映焦?fàn)t逸散物染毒24h和5d的炎性損傷，IL-10可以反映焦?fàn)t逸散物有機(jī)提取物染毒16HBE細(xì)胞