焦爐逸散物有機提取物對支氣管上皮細胞損傷的實驗研究.pdf

1、目的：焦爐逸散物（coke oven emission，COE）是在焦化生產過程中釋放的主要環(huán)境污染物，除顆粒物外，具有多種致突變和致癌性的多環(huán)芳烴。長期暴露于COE容易引發(fā)機體產生慢性炎癥和腫瘤，而炎癥又可以促進腫瘤細胞的轉化、生長和轉移。本研究應用不同染毒劑量的焦爐逸散物有機提取物作用于16HBE細胞建立24h和5d細胞染毒模型。初步探討焦爐逸散物有機提取物對支氣管上皮細胞的損傷情況。為后續(xù)COE暴露人群的效應性生物標志物分析提供依

2、據和線索。
　　方法：1 COE有機提取物作用于16HBE細胞建立24h染毒模型：將人支氣管上皮細胞系16HBE接種在含有10％的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，在37℃和5% CO2的條件下傳代培養(yǎng)。當細胞融合率達70%時用不同濃度的焦爐逸散物有機提取物處理24h，作用濃度依次為5mg/L、10mg/L、20mg/L，胎牛血清濃度為5%。同時設置0.1%DMSO的COE溶劑對照，每個劑量組均設置平行樣。2 COE有機提取物作用于16H

3、BE細胞5d染毒模型建立：細胞培養(yǎng)條件、染毒物質的劑量與24h模型相同，連續(xù)染毒5d，每次更換新的含COE有機提取物的培養(yǎng)基，每個劑量組均設立平行樣。3應用MTT和乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗評估COE對16HBE細胞的細胞毒性。4應用流式細胞儀檢測16HBE細胞內活性氧（ROS）的釋放水平。5應用彗星實驗檢測16HBE細胞的DNA損傷情況。6應用懸液芯片 Human Th17 Cytokine Panel15-Plex檢測上清液中IL

4、-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-31、IL-33、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、可溶性細胞表面分化抗原40配體（sCD40L）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達情況。7應用蛋白免疫印跡方法檢測IκBα、P-IκBα、P65和P-P65蛋白表達水平。
　　結果：120mg/L COE有機提取物染毒16HBE細胞24h后，細

5、胞存活率為89.38%（P＜0.05），LDH釋放量為147.68%（P＜0.05）。10 mg/L和20 mg/L COE有機提取物染毒16HBE細胞5d后，LDH釋放量分別為124.39%和149.64%（P＜0.01）。說明 COE有機提取物可以損傷16HBE細胞，染毒周期增加，毒性亦增加。2 COE有機提取物無論24h染毒還是5d染毒均能檢測到活性氧的釋放，隨著染毒劑量的增加而逐漸升高（P＜0.01）。在24h染毒的模型中，5m

6、g/L低劑量組的細胞平均熒光強度相較對照組增加的倍數值比在5d模型中低。在24h模型中增加的倍數是14.47倍，5d模型中為17.85倍。3單細胞凝膠電泳結果顯示，細胞出現DNA損傷。20mg/L COE有機提取物染毒16HBE細胞24h后，尾部DNA百分含量增加83.51%（P＜0.01），Olive尾距指標增加76.47%（P＜0.05）。20mg/L COE有機提取物染毒16HBE細胞5d后，尾部DNA百分含量與對照組相比較增加8

7、9.28%（P＜0.01），Olive尾距指標值增加量為照組的117.07%（P＜0.01）。4 COE有機提取物染毒16HBE細胞24h后，IL-10的表達量分別是1.25±0.54、1.39±0.13和（1.90±0.73） pg/mL，具有良好的劑量-效應關系（r=0.98，P＜0.05）。IL-23僅在該模型的中、高劑量組表達。COE有機提取物染毒16HBE細胞5d后，IL-10在各劑量組的表達量依次為1.71±0.02、1.4

8、9±0.13和（2.82±0.16） pg/mL。IL-1β僅在該模型中表達。表明 COE有機提取物影響16HBE細胞炎性因子的表達。5 COE有機提取物染毒24h對16HBE細胞中NF-κB通路蛋白表達的影響：IκBα蛋白表達量呈現下降趨勢，在5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L COE組下降量分別為對照組的26%、33%和56%（P＜0.05）。P-IκBα蛋白表達量在中、高劑量組上升顯著，在10mg/L COE組中的增加量

9、為對照組的79%（P＜0.05），在20 mg/L COE組的表達量是對照組的2.02倍（P＜0.05）。P-P65在10 mg/L COE組的表達量為對照組的3.84倍（P＜0.05），在20 mg/L COE處理組，其表達量為對照組的6.43倍（P＜0.05）。P65蛋白表達量無明顯變化。
　　結論：1、IL-23和IL-1β分別反映焦爐逸散物染毒24h和5d的炎性損傷，IL-10可以反映焦爐逸散物有機提取物染毒16HBE細胞