RNA干擾用于支氣管上皮細胞5-脂氧合酶對苯并(a)芘活化及DNA損傷研究.pdf

1、[目的]研究人支氣管上皮細胞(HBE)中苯并(a)芘氧化活化與DNA損傷的關(guān)系，進一步證實LOX是P450氧化代謝的替代途徑，也為LOXsiRNA可能通過抑制LOX發(fā)揮防治化學物毒性作用的新線索提供有力證據(jù)。
　　 [方法]基因沉默實驗:通過AgeI和EcoRI酶切質(zhì)粒并用T4Ligase和shRNA Oligo片段連接，構(gòu)建pAJ-U6-shRNA-CMV-GFP重組體，通過慢病毒載體系統(tǒng)，進行共轉(zhuǎn)染293T細胞最后得到病毒濃

2、縮液來感染目的細胞，之后通過PCR和Western-blot的方法檢測基因沉默的效果。
　　 細胞實驗:以不同濃度的苯并(a)芘對HBE細胞和經(jīng)5-LOXsiRNA處理后的細胞組染毒，通過MTT實驗檢測苯并(a)芘對兩組細胞存活率的影響;用Western-blot印記法檢測各組5-LOX蛋白表達的情況;同時用單細胞凝膠電泳實驗及流式細胞計數(shù)檢測各組的DNA損傷情況。最后檢測苯并(a)芘染毒后經(jīng)過5-LOXsiRNA和化學抑制劑處

3、理組對細胞的毒性和DNA損傷，并比較化學抑制劑和5-LOXsiRNA的細胞組抑制效果的差異。
　　 [結(jié)果]通過PCR鑒定轉(zhuǎn)化子和陽性克隆后的測序以及病毒感染HBE細胞后通過PCR和Western-blot的方法檢測，說明沉默5-LOX基因位點是較為成功。苯并(a)芘可以使HBE細胞內(nèi)5-LOX蛋白表達增加，AA-861對5-LOX蛋白表達基本沒有影響;苯并(a)芘可以對HBE產(chǎn)生明顯細胞毒作用和DNA損傷，經(jīng)5-LOXsiRN

4、A，5-LOX抑制劑AA-861處理后的細胞組可以抑制苯并(a)芘毒性和DNA損傷，且5-LOXsiRNA細胞組抑制效果最為顯著。
　　 [結(jié)論]5-LOX在HBE細胞內(nèi)的蛋白表達可以經(jīng)苯并(a)芘調(diào)節(jié)，特異性5-LOX抑制劑AA-861和5-LOXsiRNA都可抑制苯并(a)芘對細胞的毒性和DNA損傷，推測B(a)P可能是主要通過5-LOX介導的氧化活化生成親電子物質(zhì)，與DNA結(jié)合導致其損傷;這種DNA損傷可能與B(a)P的致