RNA干擾用于支氣管上皮細(xì)胞5-脂氧合酶對苯并(a)芘活化及DNA損傷研究.pdf

1、[目的]研究人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)中苯并(a)芘氧化活化與DNA損傷的關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)LOX是P450氧化代謝的替代途徑，也為LOXsiRNA可能通過抑制LOX發(fā)揮防治化學(xué)物毒性作用的新線索提供有力證據(jù)。
　　 [方法]基因沉默實(shí)驗(yàn):通過AgeI和EcoRI酶切質(zhì)粒并用T4Ligase和shRNA Oligo片段連接，構(gòu)建pAJ-U6-shRNA-CMV-GFP重組體，通過慢病毒載體系統(tǒng)，進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞最后得到病毒濃

2、縮液來感染目的細(xì)胞，之后通過PCR和Western-blot的方法檢測基因沉默的效果。
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn):以不同濃度的苯并(a)芘對HBE細(xì)胞和經(jīng)5-LOXsiRNA處理后的細(xì)胞組染毒，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測苯并(a)芘對兩組細(xì)胞存活率的影響;用Western-blot印記法檢測各組5-LOX蛋白表達(dá)的情況;同時用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測各組的DNA損傷情況。最后檢測苯并(a)芘染毒后經(jīng)過5-LOXsiRNA和化學(xué)抑制劑處

3、理組對細(xì)胞的毒性和DNA損傷，并比較化學(xué)抑制劑和5-LOXsiRNA的細(xì)胞組抑制效果的差異。
　　 [結(jié)果]通過PCR鑒定轉(zhuǎn)化子和陽性克隆后的測序以及病毒感染HBE細(xì)胞后通過PCR和Western-blot的方法檢測，說明沉默5-LOX基因位點(diǎn)是較為成功。苯并(a)芘可以使HBE細(xì)胞內(nèi)5-LOX蛋白表達(dá)增加，AA-861對5-LOX蛋白表達(dá)基本沒有影響;苯并(a)芘可以對HBE產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒作用和DNA損傷，經(jīng)5-LOXsiRN

4、A，5-LOX抑制劑AA-861處理后的細(xì)胞組可以抑制苯并(a)芘毒性和DNA損傷，且5-LOXsiRNA細(xì)胞組抑制效果最為顯著。
　　 [結(jié)論]5-LOX在HBE細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)可以經(jīng)苯并(a)芘調(diào)節(jié)，特異性5-LOX抑制劑AA-861和5-LOXsiRNA都可抑制苯并(a)芘對細(xì)胞的毒性和DNA損傷，推測B(a)P可能是主要通過5-LOX介導(dǎo)的氧化活化生成親電子物質(zhì)，與DNA結(jié)合導(dǎo)致其損傷;這種DNA損傷可能與B(a)P的致