Fibrinogen與足細(xì)胞損傷及腎臟疾病進(jìn)展的研究.pdf

1、目的：
　　已有研究報道TLR4表達(dá)在免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和足細(xì)胞。Fibrinogen可以通過Toll-like receptor4(TLR4)參與血管壁疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的炎癥。Fibrinogen激活巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子、單核細(xì)胞趨化蛋白1。
　　足細(xì)胞損傷是形成蛋白尿的一個重要原因，可導(dǎo)致腎小球硬化癥。有報道體外實驗中fibrinogen通過TLR4刺激足細(xì)胞分泌趨化因子和細(xì)

2、胞因子。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)尿液fibrinogen水平在局灶節(jié)段腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)患者中是顯著升高的。
　　Fibrinogen是否可以通過TLR4信號通路導(dǎo)致足細(xì)胞破壞尚未可知。因此，本研究的目的:(1)探索fibrinogen是否導(dǎo)致足細(xì)胞細(xì)胞骨架破壞和凋亡增加？(2)Fibrinogen是否通過TLR4-p38MAPK-NFκB P65信號通路介導(dǎo)上述

3、效應(yīng)？(3)Fibrinogen是否參與FSGS中足細(xì)胞的損傷？
　　材料與方法：
　　(1)在體外培養(yǎng)的人足細(xì)胞中加入fibrinogen（分別為20μg/ml，200μg/ml，800μg/ml三個劑量），對照組加入等量PBS;分別孵育12h和24h。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率情況和免疫熒光檢測細(xì)胞骨架F-actin。
　　在體外siRNA轉(zhuǎn)染實驗中，先分別利用controlsiRNA、TLR4siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞1

4、2h，再加入fibrinogen（800μg/ml）孵育24h。然后通過qRT-PCR檢測TLR4mRNA水平，觀察阻斷效果。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測足細(xì)胞凋亡率，免疫熒光檢測F-actin。同時Western Blot檢測足細(xì)胞TLR4、總NFκB p65、磷酸化NFκBp65、總p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平。
　　(2)在阿霉素小鼠FSGS模型中，分別于第1周、2周、4周、6周收集尿和腎臟。檢測尿ACR(the rat

5、io of albumin to creatinine);利用ELISA法檢測尿上清液fibrinogen的水平。對尿液fibrinogen與尿ACR、足突融合進(jìn)行相關(guān)性分析。對小鼠腎臟進(jìn)行病理檢查(PAS染色、光鏡、電鏡);免疫熒光雙重染色分別檢測podocin與TLR4，fibrinogen與TLR4的共定位表達(dá)水平。
　　統(tǒng)計學(xué)方法:
　　所有的細(xì)胞實驗重復(fù)三次以上。連續(xù)變量數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)或中位數(shù)（四分位間

6、距，第25和第75百分位數(shù)）表示。GraphPad Prism5軟件(La Jolla，CA)進(jìn)行統(tǒng)計分析，雙側(cè)t檢驗、非參數(shù)檢驗用來分析任意兩組間的差異。變量之間的相關(guān)性使用Spearman's相關(guān)分析方法進(jìn)行。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01認(rèn)為差異更顯著。
　　結(jié)果：
　　(1)200μg/ml，800μg/ml fibrinogen干預(yù)可引起足細(xì)胞細(xì)胞骨架F-actin的明顯破壞和凋亡率顯著增高，與未處理組

7、比較該差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)在轉(zhuǎn)染實驗中，與control siRNA+fibrinogen組比較，TLR4siRNA+fibrinogen(800μg/ml)組中足細(xì)胞的凋亡率顯著降低，F(xiàn)-actin的破壞亦明顯減輕。TLR4mRNA表達(dá)下調(diào)和蛋白表達(dá)減少;磷酸化NFκB p65和磷酸化p38MAPK的水平降低，F(xiàn)ibrinogen介導(dǎo)的TLR4信號通路下游分子NFκB p65和p38MAPK的活化被抑制。
　　(

8、3)阿霉素小鼠FSGS模型的尿液ACR和fibrinogen水平顯著高于生理鹽水處理小鼠組，并且尿液fibrinogen和ACR成正相關(guān)(r=0.65，P＜0.001)。6周時阿霉素處理組小鼠的腎臟PAS染色可見FSGS樣病理改變，電鏡示足突融合程度較生理鹽水處理組嚴(yán)重(P＜0.001)。免疫熒光雙重染色結(jié)果顯示:阿霉素處理組小鼠腎臟podocin的表達(dá)較生理鹽水組顯著減低(P=0.0001);而fibrinogen與TLR4共定位表達(dá)