胰淀素對(duì)足細(xì)胞的損傷及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常見的微血管病變之一，也是近年來引起終末期腎臟疾病(end stage renal disease，ESRD)和糖尿病患者死亡的重要原因。微量蛋白尿作為早期診斷DN的臨床指標(biāo)，對(duì)于疾病的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。蛋白尿的產(chǎn)生主要是由于腎小球?yàn)V過屏障的損傷，導(dǎo)致對(duì)蛋白通透性增加。而足細(xì)胞(Podocyte)作為腎小球?yàn)V過屏障的最后一層結(jié)構(gòu)，是附著在腎

2、小球基底膜外側(cè)高度分化的細(xì)胞，能從胞體伸出許多突起，形成一級(jí)和次級(jí)足突，相鄰足突之間又形成直徑為30-40nm的滲透性裂孔隔膜(silt diaphragam，SD)，足細(xì)胞及其裂孔隔膜的完整性對(duì)維持腎小球?yàn)V過功能具有重要作用，足細(xì)胞的損傷會(huì)促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。
　　胰淀素(Amylin)是由37個(gè)氨基酸組成，胰島β細(xì)胞合成并分泌的胰島淀粉樣多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP），胰淀素和胰島素

3、(Insulin)基因共享一個(gè)啟動(dòng)子，所以兩者共同合成共同分泌。生理情況下，Amylin能夠協(xié)同調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的能量代謝，延遲胃排空[4]、抑制胃酸[5]和胰高血糖素的分泌，增加飽感。1型糖尿病患者，由于缺乏胰島β細(xì)胞，所以不會(huì)形成過量的Amylin，而在2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)和胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)患者中，胰島素分泌相對(duì)增加，高胰島素血癥不可避免的伴隨著

4、Amylin水平的升高。研究表明Amylin水平過高，會(huì)刺激人體血漿中腎素、血管緊張素含量的增加，即Amylin和系統(tǒng)性腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-angiotensin system，RAS）的激活具有一定的相關(guān)性，可以對(duì)多種器官組織造成損傷。報(bào)道顯示，約70％-90％的T2DM患者有胰島淀粉樣變性，其沉積物的主要成分為Amylin。過多的Amylin能夠在腎臟沉積，而足細(xì)胞又可以內(nèi)源性表達(dá)RAS的各種組分，所以，我們推測(cè)Amy

5、lin可能會(huì)通過激活足細(xì)胞局部的RAS損傷足細(xì)胞，從而參與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究采用高濃度的活性人胰淀素（Human Amylin1-37 Peptide），在高糖(25mmol/l)環(huán)境下處理培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞，觀察其對(duì)足細(xì)胞相關(guān)蛋白和足細(xì)胞凋亡的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。
　　材料與方法：
　　在不含有重組小鼠IFN-γ的高糖(25mmol/L)RPMI1640培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞成熟分化。其中以高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞作為對(duì)

6、照組（HG，A組），分別將高糖環(huán)境加藥物處理的足細(xì)胞分為以下5組:B1為HG+Amylin（0.5μmol/l）處理組;B2為HG+Amylin（1.0μmol/l）處理組;B3為HG+Amylin（2.0μmol/l）處理組;C組為HG+Amylin（1.0μmol/l）+Captopril（卡托普利）處理組;D組HG+Amylin（1.0μmol/l）+Valsartan（纈沙坦）處理組。各組細(xì)胞和藥物孵育48h后，進(jìn)行細(xì)胞收割。用

7、光學(xué)顯微鏡觀察足細(xì)胞分化前后的形態(tài)變化;RT-PCR檢測(cè)足細(xì)胞相關(guān)蛋白Nephrin、Podocin、DesminmRNA的表達(dá);Western blot檢測(cè)Nephrin、Podocin、Desmin的蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1.在光學(xué)顯微鏡下可見，分化前后足細(xì)胞的形態(tài)明顯不同。在33℃未分化的足細(xì)胞顯示為鵝卵石樣，細(xì)胞胞體較小，37℃完全分化的足細(xì)胞則表現(xiàn)為分叉的樹枝狀、星型，而且胞體也明顯增大。
　　2.和A

8、組相比，B1、B2、B3組Nephrin、Podocin mRNA和蛋白的表達(dá)減少，Desmin的mRNA和蛋白的表達(dá)增加;隨著處理組Amylin濃度的增加，B1、B2、B3組Nephrin、Podocin mRNA和蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性的減少，而B1、B2、B3組的Desmin表達(dá)也呈劑量依賴性增加(均P＜0.05)。
　　3.與B1組相比，C組以及D組的Nephrin、Podocin mRNA和蛋白的表達(dá)都有所升高(均P＜0