醛固酮對(duì)足細(xì)胞的損傷機(jī)制.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、醛固酮通過TGF-β1途徑調(diào)節(jié)足細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶2和9
　　 目的：觀察醛固酮（Aldosterone，ALD）及其受體拮抗劑刺激對(duì)足細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases，MMP-2）和9（MMP-9）、IV型膠原的影響及探討ALD對(duì)足細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）分泌、降解的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方

2、法：(1)為觀察ALD對(duì)足細(xì)胞ECM 分泌、降解作用的量效、時(shí)效關(guān)系，分別用不同濃度（10-11M、10-9 M、10-7M）、不同作用時(shí)間（24h、48h、72h）ALD作用于足細(xì)胞并設(shè)立空白對(duì)照組，明膠酶譜、Western blot、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法檢測(cè)足細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9、IV型膠原α5 鏈、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transfo

3、rming growth factor-β1，TGF-β1）的變化，流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)足細(xì)胞黏附率變化。(2)為觀察ALD對(duì)足細(xì)胞的作用是否通過鹽皮質(zhì)激素受體（mineralocorticoid receptor，MR）介導(dǎo)，應(yīng)用ALD 受體拮抗劑螺內(nèi)酯（Spironolactone，SPI）預(yù)處理細(xì)胞后，再加入ALD 刺激，檢測(cè)以上指標(biāo)的變化。(3)為觀察TGF-β信號(hào)通路是否參與了ALD對(duì)足細(xì)胞的作用，應(yīng)用TGF-β1 受體抑制劑S

4、B431542 預(yù)處理細(xì)胞后，再加入ALD 刺激，檢測(cè)足細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9活性、IV型膠原α5 鏈蛋白表達(dá)及足細(xì)胞黏附率的變化。
　　 結(jié)果：(1)與對(duì)照組相比，ALD可以時(shí)間及劑量依賴性方式導(dǎo)致培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9活性升高（P<0.05）；IV型膠原α5 鏈蛋白表達(dá)下降（P<0.05）；TGF-β1 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。(2)ALD 受體拮抗劑SPI可完全阻斷上述變化（P<0.05）

5、。(3)TGF-β1 受體抑制劑SB431542可部分阻斷ALD 刺激引起的培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9活性升高及IV型膠原α5 鏈蛋白、足細(xì)胞黏附率的下降（P<0.05）。(4)對(duì)足細(xì)胞表達(dá)MMP-2、MMP-9、TGF-β1 及IV型膠原α5 鏈蛋白分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9的活性與IV型膠原α5 鏈蛋白的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），MMP-2、MMP-9的活性與TGF-β1 蛋白

6、的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。
　　 結(jié)論：ALD可通過TGF-β1 途徑使足細(xì)胞產(chǎn)生MMP-2、MMP-9活性升高，IV型膠原α5 鏈蛋白表達(dá)下降，足細(xì)胞黏附率下降，從而使足細(xì)胞分泌基底膜（glomerular basement membrane，GBM）成分異常，GBM 合成及降解失衡，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。
　　 第二部分、醛固酮促進(jìn)足細(xì)胞凋亡：活性氧的作用
　　 目的：觀察ALD 及其受體拮抗劑對(duì)活性氧（

7、reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生、足細(xì)胞凋亡的影響，并觀察抗氧化劑對(duì)ALD誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的干預(yù)效果。
　　 方法：(1)為觀察ALD 及其受體拮抗劑對(duì)活性氧產(chǎn)生、足細(xì)胞凋亡的影響，將足細(xì)胞分為空白對(duì)照組、ALD組、SPI組、ALD+SPI組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡的變化，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)足細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的變化，間接免疫熒光檢測(cè)足細(xì)胞Nephrin的變化，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse t

8、ranscription polymerase chainreaction，RT-PCR）、Western blot方法檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA 及蛋白水平的變化。
　　 (2)為觀察ROS是否參與了ALD對(duì)足細(xì)胞的作用，應(yīng)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）預(yù)處理細(xì)胞后，再加入ALD 刺激，流式細(xì)胞儀、間接免疫熒光檢測(cè)足細(xì)胞凋亡及Nephrin表達(dá)的變化，RT-PCR、Western

9、blot方法檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA 及蛋白水平的變化。
　　 結(jié)果：(1)與對(duì)照組相比，ALD可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生增多（P<0.05）；Nephrin表達(dá)降低（P<0.05）；Bax mRNA 及蛋白表達(dá)升高（P<0.05）；
　　 Bcl-2 mRNA 及蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。ALD 受體拮抗劑SPI可完全阻斷上述變化（P<0.05）。(2)抗氧化劑可明顯抑制ALD 刺激引起的足細(xì)胞凋

10、亡（P<0.05）及Nephrin表達(dá)下調(diào)（P<0.05），降低足細(xì)胞中Bax mRNA 及蛋白的表達(dá)（P<0.05），升高Bcl-2 mRNA 及蛋白的表達(dá)（P<0.05）。
　　 結(jié)論：ALD可通過作用于MR 上調(diào)促凋亡因子Bax mRNA 及蛋白的表達(dá)，下調(diào)抑凋亡因子Bcl-2 mRNA 及蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，這一作用可能是通過ROS介導(dǎo)的。
　　 第三部分、依普利酮對(duì)阿霉素腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用
　　

11、 目的：探討依普利酮對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟病變的影響。
　　 方法：(1)36只健康、成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、阿霉素模型組、依普利酮干預(yù)組（100mg.kg-1.d-1）。一次性尾靜脈注射阿霉素造模，依普利酮干預(yù)組于術(shù)前1天開始用相應(yīng)藥物等量灌胃，給藥28天。對(duì)照組和模型組以等量蒸餾水灌胃28天。(2)生化指標(biāo)檢測(cè)：第28天各組大鼠處死前測(cè)血壓及收集24h 尿液檢測(cè)尿蛋白含量，處死時(shí)取血檢測(cè)血鉀、鈉、肌酐。(3

12、)左側(cè)腎組織行HE、PAS 染色，并制作電鏡標(biāo)本，觀察腎小球及足細(xì)胞病變情況。(4)免疫組化、Western blot方法檢測(cè)腎皮質(zhì)中TGF-β1、結(jié)蛋白（desmin）表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：(1)生化指標(biāo)、血壓：各組大鼠血清鈉、鉀、肌酐、血壓之間均無顯著性差異（P>0.05）；阿霉素模型組24h尿蛋白排泄量較對(duì)照組顯著升高（P<0.01），依普利酮干預(yù)組24h尿蛋白排泄量較阿霉素組顯著降低（P<0.05）。(2)腎組織病理學(xué)

13、改變：與對(duì)照組比較，PAS染色顯示阿霉素模型組術(shù)后第28天部分腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕度增生，電鏡結(jié)果顯示彌漫性足細(xì)胞損傷，足突扁平、變形、融合，而依普利酮干預(yù)組大鼠腎小球系膜增生及足突融合程度均較阿霉素模型組明顯減輕。(3)免疫組化：與對(duì)照組相比，阿霉素模型組腎小球中TGF-β1、desmin表達(dá)顯著升高（P<0.01），而依普利酮干預(yù)組腎小球中TGF-β1、desmin表達(dá)均較阿霉素模型組明顯減少（P<0.05）。(4)Western