W1對血小板ADP受體信號通路的影響及有關藥物研究.pdf

1、W1作為一個新型合成化合物，其結構包含2-O-氯吡格雷和阿司匹林，前者為氯吡格雷在體內的第一步氧化代謝產物。W1的合成理念主要基于氯吡格雷的前藥屬性，且其代謝產物的不穩(wěn)定性，旨在減輕或克服氯吡格雷臨床使用中存在的主要問題。
　　氯吡格雷在臨床上廣泛應用于抗血栓治療，其體內活化過程需要經過肝臟CYP450酶的兩步氧化代謝，其代謝酶的主要亞型為CYP2C19和CYP3A4。因此，氯吡格雷的藥效通常受到機體CYP450酶活性的影響，比如

2、患者出現上述酶活性先天不足或配伍給藥使得酶活性被抑制的情形，后者包括質子泵抑制劑（如奧美拉唑）或降膽固醇藥物（如他汀類藥物）等臨床常用藥物，這些因素皆可使氯吡格雷無法達到預期療效，即出現“氯吡格雷抵抗”現象，這已成為氯吡格雷最令人擔心的問題。
　　前期的藥效學研究表明，W1具有強于氯吡格雷的抗血小板效應，而且能夠明顯減輕“氯吡格雷抵抗”現象。本研究主要就W1的作用機制進行分析，著重觀察其對血小板ADP受體P2Y12信號通路的影響，

3、此外，還對可能影響氯吡格雷藥效的配伍藥物奧美拉唑和辛伐他汀進行了相關研究。
　　第一部分W1對血小板ADP受體信號通路的影響。以Wistar大鼠為實驗對象，將動物分為三個組:正常對照組、氯吡格雷組(10mg/kg)和W1組(3mg/kg)，氯吡格雷和W1分別以0.5％的甲基纖維素(MC)溶液充分混懸，二者均為單次給藥，采用灌胃口服途徑，正常對照組僅服用等體積的MC混懸液。各組動物給藥后4小時，麻醉并抽取腹主動脈血液，離心制備洗滌血

4、小板，分別用于ADP受體信號通路分子的蛋白表達檢測和血小板鋪展實驗。在信號分子的蛋白表達檢測中，各組動物血小板以ADP(終濃度為50μM)處理5分鐘，正常對照動物血小板另設非ADP處理組。ADP處理完畢，提取血小板蛋白，通過Western blot方法檢測磷酸化Akt、Erk蛋白以及Rap1蛋白的表達情況。在進行血小板鋪展實驗時，以FITC-鬼筆環(huán)肽染色血小板，在激光共聚焦顯微鏡下對血小板加以觀察，通過測定單個血小板面積反映其鋪展情況。

5、Western blot檢測結果表明，與正常對照組相比，W1給藥組大鼠血小板的磷酸化Akt、Erk蛋白及Rap1蛋白的表達均受到抑制，氯吡格雷組可觀察到同樣的結果。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，與正常對照組相比，W1及氯吡格雷給藥組大鼠血小板的面積明顯減小，表明W1可以抑制血小板在纖維蛋白原上的鋪展，阻斷了纖維蛋白原受體的活化。
　　第二部分辛伐他汀對氯吡格雷的影響。將Wistar大鼠分為三組:氯吡格雷（10 mg/kg）組、氯吡

6、格雷（10 mg/kg）+辛伐他汀(40 mg/kg)組、氯吡格雷(10 mg/kg)+辛伐他?。?0 mg/kg）組，各組均為單次灌胃口服給藥。按照第一部分的主要方法，觀察辛伐他汀配伍給藥對氯吡格雷的影響。結果表明，大鼠血小板在Akt磷酸化蛋白表達及面積變化方面，未檢測到辛伐他汀對氯吡格雷產生顯著影響。為進一步分析原因，一方面，我們將辛伐他汀(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M)作用于HepG2培養(yǎng)細胞，分

7、別以Q-PCR及Western blot檢測細胞CYP3A4在mRNA和蛋白的表達水平;另一方面，將辛伐他汀(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M)與表達人CYP450s同工酶和人CYP450s還原酶的昆蟲細胞微粒體共同孵育，通過熒光強度的變化分析辛伐他汀對CYP3A4酶活性的影響。結果表明，辛伐他汀沒有影響到HepG2細胞CYP3A4在mRNA和蛋白水平的表達，對體外肝微粒體CYP3A4的酶活性亦未產生明顯影響。

8、　　第三部分奧美拉唑對HepG2細胞CYP2C19表達的影響。將奧美拉唑(0、0.1、1、10 mg/L)作用于HepG2細胞24小時，采用Q-PCR及Westernblot檢測細胞中CYP2C19的mRNA和蛋白表達。奧美拉唑(0、0.1、1、10、100 mg/L)與表達人CYP450s同工酶和人CYP450s還原酶的昆蟲細胞的微粒體共同孵育，在體外水平上通過熒光強度的變化分析奧美拉唑對CYP2C19酶活性的影響。結果顯示，在mRN

9、A及蛋白表達水平上，奧美拉唑各濃度組均抑制CYP2C19酶的表達，且具有濃度依賴性。酶活性檢測表明，當奧美拉唑的濃度達到10 mg/L、100 mg/L時，熒光強度明顯減弱，表明高濃度的奧美拉唑抑制CYP2C19酶的表達。
　　結論:W1可明顯抑制大鼠血小板Akt、Erk及Rap1的蛋白表達，而它們正是ADP受體信號通路的重要分子，提示W1通過作用于ADP受體發(fā)揮其抗血小板作用;在大鼠體內未檢測到辛伐他汀對氯吡格雷產生明顯影響，包