GPCR信號通路研究模型的建立與應用及孤兒受體的藥物篩選.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors, GPCRs）主要通過激活G蛋白調節(jié)下游信號，從而參與某些生理病理反應，而β-arrestin作為細胞內的一種重要骨架蛋白，在絕大部分GPCR介導的信號轉導中具有重要調節(jié)作用，調控GPCR脫敏、內吞、細胞增殖和基因轉錄，因此通過研究GPCR與β-arrestin的相互作用來研究GPCR介導的β-arrestin信號通路顯得非常必要。本文通過構建叩頭蟲熒光素酶（Bra

2、zilian Cratomorphus distinctus;Emerald Luc;ELuc）片段分別與AGTR1(β2AR, GCGR)和β-arrestin1/2融合表達質粒，其N端（1-415 aa）與β-arrestin1/2 N端融合（ELucN-β-arrestin1/2），C端（394-542 aa）與AGTR1(β2AR, GCGR) C端融合（AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC），瞬轉至HEK293細胞中，分

3、別采用Western blot、免疫熒光染色及鈣流實驗，驗證融合表達質粒在HEK293細胞中的表達及其生物學活性，然后共轉 AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC和ELucN-β-arrestin1/2至HEK293細胞中，通過對細胞轉染條件的優(yōu)化以及化合物刺激時間的研究，檢測在配體刺激下AGTR1(β2AR, GCGR)與β-arrestin1/2相互作用情況，并利用該檢測模型對已報道的AGTR1、β2AR的偏向性激動劑進行驗證。

4、研究發(fā)現(xiàn)，在該模型檢測下Angiotensin-2、Isoproterenol分別能夠劑量依賴性的引起AGTR1、β2AR與β-arrestin1/2相互作用的改變，同時對于偏向性激動劑的驗證中，只有 Angiotensin-2能激活 AGTR1介導的 Gq信號通路，而Angiotensin-2、S-2、TRV120023均能劑量依賴性增強AGTR1與β-arrestin1/2相互作用，Isoetharine、Ethylnorepine

5、phrine在激活β2AR時更偏向于β-arrestin1/2信號通路，這些結果均與文獻報道相符，表明我們成功地構建了AGTR1、β2AR與β-arrestin1/2相互作用檢測模型，而且該模型可靠、準確，為GPCR信號轉導通路及其偏向性激動劑研究奠定了良好的基礎。
　　此外，我們按照相同的方式利用ELuc片段互補分析建立了β2AR與G蛋白相互作用檢測模型，研究了β2AR與Gα16相互作用情況，并結合免疫共沉淀的結果，我們得知在β