Ⅱ型大麻素受體激活對(duì)新生兒腦出血的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、本研究使用Ⅶ型膠原酶誘導(dǎo)p7新生大鼠腦出血，模擬臨床上新生兒腦出血(GMH)的病理生理特點(diǎn)，并通過(guò)影像學(xué)、行為學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn);針對(duì)GMH后腦小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)化以及相應(yīng)生物學(xué)特點(diǎn)，以內(nèi)源性大麻素受體(CB2R)作為干預(yù)靶點(diǎn)，探討CB2R激活調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換以及與神經(jīng)細(xì)胞相互作用的細(xì)胞、分子機(jī)制。1，為出血性腦卒中繼發(fā)神經(jīng)炎癥的調(diào)控提供新靶點(diǎn);2，為GMH及其后遺癥的臨床救治提供新思路;3，為防治GMH后神經(jīng)炎癥，改善預(yù)后提供

2、新手段。
　　第一部分 Ⅱ型大麻素受體(CB2R)在新生兒腦出血后米諾環(huán)素介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)中的作用及機(jī)制研究
　　目的:
　　該部分研究為闡明米諾環(huán)素在新生兒GMH中的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及其抗炎機(jī)制是否通過(guò)激活內(nèi)源性CB2R實(shí)現(xiàn)。
　　材料與方法:
　　研究采用Ⅶ型膠原酶(0.3U)立體定向微量注射入p7幼鼠右側(cè)生發(fā)基質(zhì)層構(gòu)建新生兒腦出血模型。通過(guò)腹腔注射米諾環(huán)素(45mg/kg)及選擇性CB2R抑制劑(AM6

3、30，1mg/kg)或選擇性激動(dòng)劑(JWH133，1.5mg/kg)及相應(yīng)安慰劑組干預(yù)共198只幼鼠，使用免疫組織化學(xué)、免疫印跡技術(shù)以及ELISA技術(shù)等檢測(cè)內(nèi)源性CB2R、小膠質(zhì)細(xì)胞以及相應(yīng)炎癥因子，如IL-6，TGF-β以及TNF-α蛋白含量，使用PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)mRNA水平，使用小動(dòng)物MRI技術(shù)檢測(cè)各組幼鼠腦皮層厚度及腦室擴(kuò)張?bào)w積。
　　結(jié)果:
　　腹腔注射米諾環(huán)素能增加GMH24小時(shí)后CB2R表達(dá)量，同時(shí)減少早期神經(jīng)

4、炎癥因子的釋放，減輕幼鼠腦含水量以及活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù);28天7.0T MRI T2加權(quán)像提示米諾環(huán)素可顯著減輕GMH誘導(dǎo)的腦室體積擴(kuò)大以及增加幼鼠腦皮層厚度。使用CB2R選擇性抑制劑AM630在誘導(dǎo)GMH前1小時(shí)腹腔注射可顯著逆轉(zhuǎn)米諾環(huán)素的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素具有減輕GMH后早期腦水腫，抑制神經(jīng)炎癥等保護(hù)效應(yīng)，當(dāng)使用CB2R選擇性抑制劑時(shí)米諾還素的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)被抑制，證實(shí)米諾環(huán)素可能是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞

5、膜蛋白CB2R的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，為GMH及其并發(fā)癥提供新的研究靶點(diǎn)。
　　第二部分 外源性激活CB2R改善GMH后繼發(fā)炎癥腦損傷的作用及機(jī)制研究
　　目的:
　　通過(guò)體內(nèi)外研究證實(shí)外源性激活CB2R對(duì)GMH后小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化的作用以及MAPK/ERK的磷酸化在該過(guò)程中的作用。
　　材料與方法:
　　在GMH幼鼠模型的基礎(chǔ)上，腹腔注射CB2R選擇性抑制劑(AM630，1mg/kg)或CB2R選擇性激

6、動(dòng)劑（JWH133，1.5mg/kg）。檢測(cè)內(nèi)源性大麻素受體激活后GMH介導(dǎo)的幼鼠腦水腫變化（腦水含量）、神經(jīng)元凋亡以及小膠質(zhì)細(xì)胞MAPK/ERK信號(hào)通路磷酸化情況;離體培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞，使用凝血酶（Thrombin，紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物之一）作為至傷物構(gòu)建離體腦出血單一因素環(huán)境，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞在凝血酶以及JWH133干預(yù)后的增殖情況以及MAPK/ERK信號(hào)通路磷酸化程度。
　　結(jié)果:
　　腹腔注射CB2R選擇性激動(dòng)劑JWH13

7、3與注射米諾環(huán)素具有相似的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，如減輕GMH誘導(dǎo)的腦水腫以及減輕腦室擴(kuò)張，減少血腫周圍小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化，同時(shí)JWH133能減少血腫周圍神經(jīng)元的凋亡。通過(guò)在體與離體實(shí)驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)JWH133能抑制MAPK/ERK蛋白磷酸化水平，進(jìn)而減少活化小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化。
　　結(jié)論:
　　外源性激活CB2R通過(guò)抑制GMH后小膠質(zhì)細(xì)胞MAPK/ERK磷酸化水平，減少激活小膠質(zhì)增殖、分化，同時(shí)減少神經(jīng)炎癥因子的釋放并干預(yù)繼發(fā)性腦

8、損傷。該研究進(jìn)一步闡明CB2R在GMH后的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為CB2R選擇性激動(dòng)劑的臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。
　　第三部分 CB2R選擇性激動(dòng)劑促進(jìn)GMH后神經(jīng)修復(fù)的作用及機(jī)制研究
　　目的:
　　該部分?jǐn)M證實(shí)CB2R選擇性激動(dòng)劑(JWH133)是否能在GMH后增加CX3CR1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，并上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(B DNF)釋放，促進(jìn)神經(jīng)再生。
　　材料與方法:
　　在CB2R選擇性抑制或激活的基礎(chǔ)上，

9、幼鼠腦室內(nèi)立體定向微量注射CX3CR1shRNA(預(yù)先構(gòu)建)。使用Brdu、M1小膠質(zhì)細(xì)胞以及M2小膠質(zhì)細(xì)胞特異性marker-CD68/CD206等檢測(cè)不同干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化。使用7.0T MRI-DTI檢測(cè)CB2R激活后神經(jīng)纖維束損傷程度，再使用免疫熒光以及Western Blot技術(shù)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元前體細(xì)胞(Neuronal precursor cells，NPCs)的相互作用以及神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖等。
　　結(jié)果

10、:
　　在JWH133治療GMH幼鼠的基礎(chǔ)上，早期腦室內(nèi)注射CX3CR1 shRNA以下調(diào)神經(jīng)系統(tǒng)CX3CR1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)JWH133能減少M(fèi)1型(CD68)活化小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，同時(shí)增加M2型(CD206)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)JWH133通過(guò)增加小膠質(zhì)細(xì)胞CX3CR1膜蛋白水平，促進(jìn)小膠質(zhì)下?lián)芟騇2形態(tài)轉(zhuǎn)換，并釋放大量神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)等，促進(jìn)GMH損傷的神經(jīng)纖維束修復(fù)

11、以及神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖、分化。
　　結(jié)論:
　　研究證實(shí)CB2R選擇性激動(dòng)劑促進(jìn)M1小膠質(zhì)細(xì)胞向M2形態(tài)轉(zhuǎn)換，釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)損傷的神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)。本研究證實(shí)CB2R激活是小膠質(zhì)細(xì)胞在病理狀態(tài)下自我調(diào)控機(jī)制啟動(dòng)的結(jié)果，如果人為加以干預(yù)，激活CB2R可達(dá)到抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，同時(shí)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞毒型向神經(jīng)保護(hù)型轉(zhuǎn)換。該研究為出血性腦卒中后繼發(fā)炎癥損傷提供新的研究思路，為新生兒腦出血及其并發(fā)癥的臨床救治提供