Ⅱ型大麻素受體激活對新生兒腦出血的神經(jīng)保護效應及機制研究.pdf

1、本研究使用Ⅶ型膠原酶誘導p7新生大鼠腦出血，模擬臨床上新生兒腦出血(GMH)的病理生理特點，并通過影像學、行為學以及細胞生物學表現(xiàn);針對GMH后腦小膠質(zhì)細胞的形態(tài)轉化以及相應生物學特點，以內(nèi)源性大麻素受體(CB2R)作為干預靶點，探討CB2R激活調(diào)控小膠質(zhì)細胞表型轉換以及與神經(jīng)細胞相互作用的細胞、分子機制。1，為出血性腦卒中繼發(fā)神經(jīng)炎癥的調(diào)控提供新靶點;2，為GMH及其后遺癥的臨床救治提供新思路;3，為防治GMH后神經(jīng)炎癥，改善預后提供

2、新手段。
　　第一部分 Ⅱ型大麻素受體(CB2R)在新生兒腦出血后米諾環(huán)素介導的神經(jīng)保護效應中的作用及機制研究
　　目的:
　　該部分研究為闡明米諾環(huán)素在新生兒GMH中的神經(jīng)保護效應及其抗炎機制是否通過激活內(nèi)源性CB2R實現(xiàn)。
　　材料與方法:
　　研究采用Ⅶ型膠原酶(0.3U)立體定向微量注射入p7幼鼠右側生發(fā)基質(zhì)層構建新生兒腦出血模型。通過腹腔注射米諾環(huán)素(45mg/kg)及選擇性CB2R抑制劑(AM6

3、30，1mg/kg)或選擇性激動劑(JWH133，1.5mg/kg)及相應安慰劑組干預共198只幼鼠，使用免疫組織化學、免疫印跡技術以及ELISA技術等檢測內(nèi)源性CB2R、小膠質(zhì)細胞以及相應炎癥因子，如IL-6，TGF-β以及TNF-α蛋白含量，使用PCR技術檢測相關mRNA水平，使用小動物MRI技術檢測各組幼鼠腦皮層厚度及腦室擴張體積。
　　結果:
　　腹腔注射米諾環(huán)素能增加GMH24小時后CB2R表達量，同時減少早期神經(jīng)

4、炎癥因子的釋放，減輕幼鼠腦含水量以及活化小膠質(zhì)細胞數(shù);28天7.0T MRI T2加權像提示米諾環(huán)素可顯著減輕GMH誘導的腦室體積擴大以及增加幼鼠腦皮層厚度。使用CB2R選擇性抑制劑AM630在誘導GMH前1小時腹腔注射可顯著逆轉米諾環(huán)素的神經(jīng)保護效應。
　　結論:
　　研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素具有減輕GMH后早期腦水腫，抑制神經(jīng)炎癥等保護效應，當使用CB2R選擇性抑制劑時米諾還素的神經(jīng)保護效應被抑制，證實米諾環(huán)素可能是通過上調(diào)細胞

5、膜蛋白CB2R的表達發(fā)揮神經(jīng)保護效應，為GMH及其并發(fā)癥提供新的研究靶點。
　　第二部分 外源性激活CB2R改善GMH后繼發(fā)炎癥腦損傷的作用及機制研究
　　目的:
　　通過體內(nèi)外研究證實外源性激活CB2R對GMH后小膠質(zhì)細胞增殖、分化的作用以及MAPK/ERK的磷酸化在該過程中的作用。
　　材料與方法:
　　在GMH幼鼠模型的基礎上，腹腔注射CB2R選擇性抑制劑(AM630，1mg/kg)或CB2R選擇性激

6、動劑（JWH133，1.5mg/kg）。檢測內(nèi)源性大麻素受體激活后GMH介導的幼鼠腦水腫變化（腦水含量）、神經(jīng)元凋亡以及小膠質(zhì)細胞MAPK/ERK信號通路磷酸化情況;離體培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細胞，使用凝血酶（Thrombin，紅細胞裂解產(chǎn)物之一）作為至傷物構建離體腦出血單一因素環(huán)境，觀察小膠質(zhì)細胞在凝血酶以及JWH133干預后的增殖情況以及MAPK/ERK信號通路磷酸化程度。
　　結果:
　　腹腔注射CB2R選擇性激動劑JWH13

7、3與注射米諾環(huán)素具有相似的神經(jīng)保護效應，如減輕GMH誘導的腦水腫以及減輕腦室擴張，減少血腫周圍小膠質(zhì)細胞增殖、分化，同時JWH133能減少血腫周圍神經(jīng)元的凋亡。通過在體與離體實驗觀察，發(fā)現(xiàn)JWH133能抑制MAPK/ERK蛋白磷酸化水平，進而減少活化小膠質(zhì)細胞增殖、分化。
　　結論:
　　外源性激活CB2R通過抑制GMH后小膠質(zhì)細胞MAPK/ERK磷酸化水平，減少激活小膠質(zhì)增殖、分化，同時減少神經(jīng)炎癥因子的釋放并干預繼發(fā)性腦

8、損傷。該研究進一步闡明CB2R在GMH后的神經(jīng)保護機制，為CB2R選擇性激動劑的臨床轉化提供理論依據(jù)。
　　第三部分 CB2R選擇性激動劑促進GMH后神經(jīng)修復的作用及機制研究
　　目的:
　　該部分擬證實CB2R選擇性激動劑(JWH133)是否能在GMH后增加CX3CR1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)量，并上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(B DNF)釋放，促進神經(jīng)再生。
　　材料與方法:
　　在CB2R選擇性抑制或激活的基礎上，

9、幼鼠腦室內(nèi)立體定向微量注射CX3CR1shRNA(預先構建)。使用Brdu、M1小膠質(zhì)細胞以及M2小膠質(zhì)細胞特異性marker-CD68/CD206等檢測不同干預后小膠質(zhì)細胞形態(tài)變化。使用7.0T MRI-DTI檢測CB2R激活后神經(jīng)纖維束損傷程度，再使用免疫熒光以及Western Blot技術觀察小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元前體細胞(Neuronal precursor cells，NPCs)的相互作用以及神經(jīng)元前體細胞增殖等。
　　結果

10、:
　　在JWH133治療GMH幼鼠的基礎上，早期腦室內(nèi)注射CX3CR1 shRNA以下調(diào)神經(jīng)系統(tǒng)CX3CR1表達，發(fā)現(xiàn)JWH133能減少M1型(CD68)活化小膠質(zhì)細胞的增殖，同時增加M2型(CD206)小膠質(zhì)細胞增殖，進一步發(fā)現(xiàn)JWH133通過增加小膠質(zhì)細胞CX3CR1膜蛋白水平，促進小膠質(zhì)下?lián)芟騇2形態(tài)轉換，并釋放大量神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣生長因子(IGF)等，促進GMH損傷的神經(jīng)纖維束修復

11、以及神經(jīng)元前體細胞增殖、分化。
　　結論:
　　研究證實CB2R選擇性激動劑促進M1小膠質(zhì)細胞向M2形態(tài)轉換，釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進損傷的神經(jīng)系統(tǒng)修復。本研究證實CB2R激活是小膠質(zhì)細胞在病理狀態(tài)下自我調(diào)控機制啟動的結果，如果人為加以干預，激活CB2R可達到抑制小膠質(zhì)細胞激活誘導的神經(jīng)炎癥，同時調(diào)控小膠質(zhì)細胞從細胞毒型向神經(jīng)保護型轉換。該研究為出血性腦卒中后繼發(fā)炎癥損傷提供新的研究思路，為新生兒腦出血及其并發(fā)癥的臨床救治提供