Gcm2基因敲除誘導(dǎo)成體小鼠甲狀旁腺功能減退的研究.pdf

1、背景：
　　Gcm(glial cells missing)基因首先是在果蠅中被發(fā)現(xiàn)的。果蠅Gcm基因缺失，神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化發(fā)生障礙，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了Gcm同源性基因Gcm1和Gcm2。Gcm1主要表達(dá)于胎盤迷路滋養(yǎng)層細(xì)胞，參與合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分化和絨毛膜的形成;Gcm2是僅在甲狀旁腺細(xì)胞中有表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子。它在調(diào)節(jié)胚胎早期甲狀旁腺細(xì)胞的分化及胚胎后期甲狀旁腺細(xì)胞的存活中起著至關(guān)重要的作用。小鼠胚胎早期敲除Gc

2、m2基因，可觀察到小鼠甲狀旁腺缺失。人類Gcm2基因的突變可以導(dǎo)致先天性家族性孤立性甲狀旁腺功能減退癥。研究表明，Gcm2在成體甲狀旁腺細(xì)胞中仍持續(xù)表達(dá)，這提示Gcm2基因除在甲狀旁腺胚胎發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮決定性作用外，可能在成熟的甲狀旁腺細(xì)胞中仍具有重要功能。然而，關(guān)于Gcm2基因的研究目前主要關(guān)注其在胚胎發(fā)育早期階段的功能，以傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)在胚胎早期便敲除了Gcm2基因，無法進(jìn)一步研究其在成體甲狀旁腺細(xì)胞中的功能。
　　Cre

3、/LoxP他莫昔芬可誘導(dǎo)性條件性基因敲除技術(shù)是近年來普遍運(yùn)用的一種基因敲除方法。該技術(shù)將雌激素受體(estrogen receptor，ER)的配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain，LBD)與Cre重組酶進(jìn)行融合，形成一種嵌合重組酶。該嵌合重組酶不能直接入核與Loxp位點(diǎn)相結(jié)合，只有在給予外源性他莫昔芬時，才能入核發(fā)揮重組作用。如此可實(shí)現(xiàn)基因敲除在時間上的把控。
　　本研究利用Cre/LoxP敲除系統(tǒng)，首次建立了

4、他莫昔芬可誘導(dǎo)的Gcm2基因敲除小鼠模型，實(shí)現(xiàn)了Gcm2基因敲除在時間上的把控。在小鼠發(fā)育成熟后腹腔注射他莫昔芬誘導(dǎo)Gcm2基因的敲除，檢測Gcm2基因敲除后小鼠機(jī)體的鈣、磷代謝情況及甲狀旁腺細(xì)胞的增殖情況。以此初步探索Gcm2基因在成體小鼠甲狀旁腺細(xì)胞中的功能，為進(jìn)一步探究甲狀旁腺功能異?；蛑委熜掳悬c(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。
　　方法：
　　1.通過基因型為Gcm2E2fl/+的F0代小鼠交配繁殖，篩選得到基因型為Gcm2E2

5、fl/fl的F1代小鼠;將其與Cre-ER轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，獲得基因型為Gcm2E2fl/+Cre-ER和Gcm2E2fl/+的F2代小鼠;將F2代小鼠進(jìn)行自交或與F1代小鼠回交，獲得基因型為Gcm2E2fl/flCre-ER的可誘導(dǎo)性條件性基因敲除小鼠;
　　2.6周齡小鼠于腹腔注射他莫昔芬誘導(dǎo)Gcm2基因敲除，連續(xù)打藥5天;
　　3.采用PCR技術(shù)鑒定敲除小鼠基因型;
　　4.采用蛋白質(zhì)印跡法檢測甲狀旁腺Gcm2

6、蛋白的表達(dá);
　　5.鈣磷測定試劑盒和ELISA檢測試劑盒分別檢測血清鈣、磷、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)及1，25(OH)2D3濃度變化;
　　6.Ki-67免疫組化染色觀察甲狀旁腺細(xì)胞的增殖變化情況;
　　7.Real-time PCR檢測甲狀旁腺和胸腺組織Gcm2、PTH及CaSR基因mRNA的表達(dá);
　　8.micro CT檢測骨代謝情況。
　　結(jié)果：
　　1

7、.經(jīng)三代繁育，獲得基因型為Gcm2E2fl/flCre-ER的可誘導(dǎo)的條件性基因敲除小鼠;
　　2.他莫昔芬誘導(dǎo)后，PCR檢測甲狀旁腺組織Gcm2基因呈敲除型;
　　3.與野生型和溶劑對照組相比，Gcm2敲除組小鼠甲狀旁腺Gcm2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P值均＜0.05）;
　　4.Gcm2敲除組血磷濃度明顯升高（P值均＜0.05），血鈣和PTH濃度顯著降低(P值均＜0.05)，血1，25(OH)2D濃度無明顯變化。

8、　　5.Gcm2敲除后HE染色發(fā)現(xiàn)，甲狀旁腺細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;
　　6.Ki-67免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Gcm2敲除組甲狀旁腺細(xì)胞增殖增強(qiáng)（P值均＜0.05）;
　　7.甲狀旁腺中PTH和CaSR的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P值均＜0.05）。胸腺PTHmRNA的表達(dá)明顯上調(diào)（P值均＜0.05），而CaSR mRNA的表達(dá)無明顯差異;
　　8.股骨ROI區(qū)域的骨體積(BV)、相對骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N

9、)、厚度(Tb.Th)及骨密度(BMD)均明顯增加（P值均＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.他莫昔芬100mg/kg連續(xù)注射5天可誘導(dǎo)成體小鼠Gcm2基因的敲除。
　　2.成體小鼠Gcm2基因敲除后表現(xiàn)為甲狀旁腺功能減退癥;
　　3.PTH和CaSR均位于Gcm2下游，成體小鼠Gcm2基因敲除后胸腺細(xì)胞可以代償性產(chǎn)生少量PTH;
　　3.成體小鼠Gcm2基因敲除后，甲狀旁腺細(xì)胞形態(tài)沒有變化，發(fā)生了代償性增