缺氧通過HIF-1α調節(jié)P311促進小鼠表皮干細胞遷移的實驗研究.pdf

1、目的：
　　P311是于1993年首次在晚期胚胎小鼠的腦組織中發(fā)現(xiàn)，P311基因表達產生約8kDa大小的胞漿蛋白，因其N末端存在PEST結構域，較易被Met-HGF-SF、泛素-蛋白酶及金屬蛋白酶等多條通路降解致其生物半衰期較短。成年人正常組織中并無P311表達，P311主要存在于神經細胞、平滑肌細胞、神經膠質細胞、軟骨細胞中，已有研究表明，P311在促進神經組織修復、創(chuàng)面愈合、腫瘤血管形成、胚胎發(fā)育，維持血壓平衡等方面發(fā)揮著重要

2、作用。然而P311蛋白質分子量較小且表達極不穩(wěn)定，這限制了對P311結構及功能的深入研究。因而迄今尚不完全明確P311的確切生物學功能及其轉錄激活調節(jié)機制，也未能將其歸入到某一特定類型的蛋白質家族當中。
　　本研究旨在通過在體外條件下模擬缺氧環(huán)境，初步研究缺氧（1％O2濃度）及常氧環(huán)境下野生型及同屬來源P311-/-新生小鼠EpSC在不同時相點的劃痕遷移速率，以及缺氧環(huán)境下野生型EpSC中HIF-1α與P311之間的相互作用。劃痕

3、實驗結果表明，缺氧早期，同種細胞缺氧條件下遷移速率較常氧條件下更快;同時，相同時相點P311-/-來源EpSC較野生型小鼠EpSC遷移速率更慢;實時熒光定量RT-PCR檢測結果提示，缺氧條件下，表皮干細胞中HIF-1α及P311mRNA水平均明顯升高。同時，HIF-1α抑制后，P311mRNA表達水平明顯下降。免疫印跡實驗及免疫細胞化學實驗結果顯示缺氧早期HIF-1α及P311蛋白表水平明顯上升。
　　綜上，缺氧條件下，EpSC中

4、P311表達增強可能受HIF-1α的轉錄激活調節(jié)，P311表達能夠促進EpSC的遷移。這為下一步進行P311生物學功能及作用機理研究提供了新的思路。
　　方法：
　　1.HIF-1α與P311在缺氧促進表皮干細胞遷移中的作用
　　1)表皮干細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　乙醚吸入麻醉新生小鼠，頸椎脫臼處死，滅菌后仔細分離皮膚組織，兩步酶法及Ⅳ型膠原蛋白快速黏附法提取表皮干細胞，定期換液并觀察細胞生長情況。
　　2)表

5、皮干細胞的流式鑒定
　　取首次傳代EpSC，待細胞生長至70％左右融合時，用抗小鼠CD71及CD49f雙抗孵育，流式細胞儀檢測兩種標志物CD71（-）/CD49f(+)的細胞百分比。
　　3)劃痕實驗檢測缺氧對表皮干細胞遷移
　　首次傳代細胞待生長融合至70％左右時，絲裂霉素C5μg/mL常溫常氧處理2h抑制其增殖，SPSS隨機分組。實驗分兩部分進行:第一部分，檢測野生型常氧組、P311-/-常氧組、野生型缺氧組、P3

6、11-/-缺氧組各組EpSC在劃痕即刻、12h、24h、48h后劃痕愈合剩余寬度;第二部分，檢測野生型缺氧組、野生型缺氧DMSO組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組各組在劃痕即刻、12h、24h、48h后劃痕愈合剩余寬度，每組每時相點設三個插件。結果以均數(shù)±標準差表示，析因設計方差分析與單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.在EpSC缺氧中HIF-1α對P311的影響
　　

7、1)免疫印跡檢測EpSC中HIF-1α的表達情況
　　分別取處于對數(shù)生長期第1代野生型及P311-/-小鼠EpSC，SPSS法隨機分組，在缺氧0h、12h、24h、48h后應用磷酸化蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用SDS-PAGE法進行免疫印跡實驗檢測EpSC中HIF-1α蛋白表達水平，凝膠成像儀下成像，Quantity one凝膠定量軟件分析灰度值，將灰度值與內參β-Tublin進行比較，結果以比值表示。各時相點之間的比較采用單因素

8、方差分析，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　2)實時熒光定量RT-PCR檢測HIF-1α對P311mRNA在EpSC中表達的影響
　　SPSS隨機分組，野生型缺氧對照組、野生型缺氧DMSO組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組EpSC缺氧處理0、12、24、48h后用TRNzol法提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA濃度及純度，進行實時熒光定量RT-PCR法檢測P311與HIF-1αmRNA的

9、表達量，以GAPDH為內參，△循環(huán)閡值(Ct)法處理結果，2-△△Ct即為mRNA相對表達量，總體比較采用析因設計及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　3)免疫細胞化學實驗檢測HIF-1α對P311在EpSC中表達的影響
　　同樣SPSS隨機分組，光學顯微鏡檢測野生型缺氧組、野生型缺氧DMSO組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組缺氧處理0、12、24、48h后Ep

10、SC中P311表達（棕色顆粒為陽性）情況。每張圖片取5個視野觀察，圖片導入Image ProPlus6.0進行分析，結果用積分吸光光度值表示?？傮w比較采用析因設計及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　3.熒光素酶報告基因實驗檢測HIF-1α對P311轉錄激活作用
　　首先對P311啟動子序列利用KOD-plus高保真酶進行PCR體外擴增，構建P311啟動子表達質粒。待HEK-293細胞

11、生長融合至約90％，瞬時轉染細胞，pGL3/basic-空載缺氧組、pGL3/basic-P311常氧組、pGL3/basic-P311缺氧組、pGL3/basic-P311-HIF-1α抑制劑組在處理即刻、12、24、48h后提取總蛋白并檢測熒光素酶活性。以pGL3/basic-P311常氧組即刻為對照，總體比較采用析因設計及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.P31

12、1及HIF-1α在缺氧促進表皮干細胞遷移中的作用
　　1)表皮干細胞純化及鑒定
　　所提取表干皮細胞經純化、流式鑒定后發(fā)現(xiàn)CD71(-)/CD49f(+)細胞占87％左右;倒置相差光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞呈鋪路石樣生長，單個細胞呈規(guī)則多邊形，細胞體積較小，核質比較大，立體感較強，符合EpSC的特征。
　　2)缺氧條件下P311及HIF-1α對表皮干細胞遷移的影響
　　與野生型缺氧組比較，P311-/-EpSC常氧

13、及缺氧、野生型HIF-1α抑制劑組12、24h劃痕剩余寬度明顯較寬;野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組12、24h劃痕剩余寬度明顯變小，P值均＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。7組間48h總體比較無差異，(F=19.02，P＞0.05).
　　2.在EpSC缺氧中HIF-1α對P311表達的影響
　　1)免疫印跡實驗檢測HIF-1α在EpSC中的表達
　　免疫印跡實驗結果表明，與常氧條件下相比，缺氧12h后野生型及P311-/-E

14、pSC中HIF-1α表達至較高水平，24h開始下降，48h與常氧無明顯差異。野生型小鼠表皮干細胞缺氧0、12、24、48h的HIF-1α蛋白表達分別為1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03，總體比較差異明顯(F=48.30，P＜0.05)。與缺氧0h比較，缺氧12h后HIF-1α蛋白表達明顯增強(P＜0.01)，缺氧24h開始下降但仍高于缺氧0h(P＜0.05)，缺氧48h后降至常氧水平(P＞0.

15、05).
　　2)實時熒光定量RT-PCR檢測HIF-1α對P311mRNA表達水平的影響
　　與單純缺氧組比較，HIF-1抑制劑組細胞缺氧各時相點P311mRNA表達均明顯下降（P值均小于0.05），HIF-1穩(wěn)定劑細胞則在缺氧12和24h明顯升高(P值均小于0.05)。與HIF-1抑制劑組比較，DMSO對照組和HIF-1穩(wěn)定劑細胞在缺氧0、12、24h P311mRNA表達均明顯升高（P值均小于0.05）。與單純缺氧組比

16、較，HIF-1抑制劑組細胞缺氧各時相點P311表達均明顯下降（P值均小于0.05），而HIF-1穩(wěn)定劑組則在缺氧12和24h明顯升高（P值均小于0.05）。與HIF-1抑制劑組比較，DMSO對照組和HIF-1穩(wěn)定劑組細胞P311表達缺氧12和24h明顯升高（P值均小于0.05）.
　　3)免疫細胞化學實驗檢測P311表達水平
　　野生型缺氧對照組、野生型DMSO對照組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組各

17、組缺氧12h后P311陽性細胞數(shù)目分別為23.1±1.2、22.5±1.1、6.2±0.8、29.6±1.3;與野生型缺氧對照組相比，野生型抑制劑組12，24h P311表達明顯下降，而野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組則明顯上升，P值均＜0.05，各組差異有明顯統(tǒng)計學意義.
　　3.HIF-1α對P311的轉錄激活作用
　　培養(yǎng)0h，空載缺氧組、P311常氧組、P311缺氧組、P311缺氧+HIF-1抑制劑組細胞熒光素酶活性差異無