丁內(nèi)酯衍生物3BD0通過降低腦內(nèi)Aβ含量改善了APP-PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠的認(rèn)知障礙.pdf

1、目的:
　　 阿爾茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)是臨床的常見病，多發(fā)病。至今沒有有效的治療藥物。細(xì)胞外β淀粉酶(Aβ)過度沉積是AD的一個(gè)標(biāo)志性病理產(chǎn)物。而且越來越多的證據(jù)顯示，自噬在Aβ代謝和AD發(fā)病中發(fā)揮一定的作用。我們近期發(fā)現(xiàn)，一種丁內(nèi)酯衍生物3BDO可以抑制細(xì)胞內(nèi)自噬泡聚積并保護(hù)細(xì)胞免受Aβ的細(xì)胞毒性作用。在此，我們利用一種成熟的阿爾茨海默氏病(AD)動(dòng)物模型——APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，研究丁內(nèi)酯

2、衍生物3BDO對(duì)Aβ代謝的作用，長期抑制自噬對(duì)AD的影響，從而探討3BDO在治療AD中的作用。以期為我們研究治療和預(yù)防AD提供了有益的參考。
　　 方法:
　　 1.3BDO為脂溶性藥物。將3BDO溶于DMSO中，濃度為200mg/ml。
　　 2.用6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，分為三組。采用微量注射器腹腔注射的方式給藥。對(duì)照組（腹腔注射NaCl），溶劑對(duì)照組（腹腔注射DMSO），實(shí)驗(yàn)組，腹腔注射3B

3、DO。注射劑量為80mg3BDO/kg小鼠體重，每只小鼠每天注射一次。平均每只小鼠注射藥物量為10ul。注射持續(xù)10周。
　　 3.采用morris水迷宮進(jìn)行小鼠的行為學(xué)檢測(cè)。全過程包含1天適應(yīng)期（沒有平臺(tái)），5天尋找隱藏平臺(tái)的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)，以及學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)24小時(shí)后，外加一天的探索實(shí)驗(yàn)。在學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中，每一次實(shí)驗(yàn)，小鼠游泳尋找隱藏平臺(tái)的時(shí)間最多為60s。如果在60s內(nèi)，小鼠沒有找到平臺(tái)，則將小鼠引導(dǎo)到平臺(tái)上。每只小鼠每天訓(xùn)練4次。平臺(tái)位

4、置在SW西南象限，起始位置為N(north)、E(east)、SE(southeast)、NW(northwest)。每天隨機(jī)使用該四個(gè)位置的一個(gè)位置，以防止小鼠不是根據(jù)平臺(tái)位置去找尋平臺(tái)，而是根據(jù)特定的左右轉(zhuǎn)向定位平臺(tái)位置。動(dòng)物找尋并爬上平臺(tái)的時(shí)間被定為潛伏期。最后一次學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24h，移除平臺(tái)進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)，用以檢測(cè)記憶能力。探索實(shí)驗(yàn)中，采用新的起始位置（東北），而且每次實(shí)驗(yàn)的時(shí)間為60s。
　　 在探索試驗(yàn)中，動(dòng)物穿越原

5、先平臺(tái)的位置次數(shù)，被用來評(píng)估學(xué)習(xí)任務(wù)的優(yōu)劣。所得數(shù)據(jù)采用重復(fù)數(shù)據(jù)的方差分析和多元方差分析。
　　 4.用硫磺素硫及免疫組化的方法，觀察小鼠腦片老年斑沉積的數(shù)量及面積。用Elisa定量分析腦內(nèi)的Aβ40及Aβ42的含量。綜合二者結(jié)果，確定3BDO治療之后，APP/PS1小鼠腦內(nèi)的老年斑數(shù)量及Aβ的含量變化。
　　 5.采用免疫印記Westernblot定量觀測(cè)小鼠腦內(nèi)與自噬有關(guān)的蛋白(LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，自噬底物蛋白P

6、62等)的含量變化，同時(shí)檢測(cè)與自噬相關(guān)的mTOR信號(hào)的底物分子——磷酸化的P70的含量，來確定3BDO對(duì)自噬及mTOR信號(hào)的影響。同時(shí)用透射電鏡觀察小鼠皮層中神經(jīng)元中的自噬泡數(shù)量。來共同確定3BDO對(duì)小鼠腦內(nèi)自噬水平的影響。
　　 6.采用免疫印記Westernblot定量觀測(cè)小鼠腦內(nèi)與Aβ代謝相關(guān)性最大的β分泌酶及Aβ降解酶的含量變化。同時(shí)檢測(cè)Aβ的前體物質(zhì)—APP的含量。BACE1是剪切生成Aβ的關(guān)鍵酶，而NEP(nepri

7、lysin)、IDE(Insulindegradationenzyme)是兩個(gè)最關(guān)鍵的Aβ降解酶。聯(lián)合分析APP、BACE1、NEP、IDE的變化，可以探索3BDO導(dǎo)致Aβ減少的相關(guān)機(jī)制。
　　 采用抗體免疫捕獲的方法將降解酶NEP、IDE從組織液中分離出來，通過激活特異性熒光底物Mca-RPPGFSAFK-OH的量來檢測(cè)NEP與IDE的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.注射后動(dòng)物無死亡，各組之間體重沒有明顯差異。

8、說明3BDO具有良好的安全性。
　　 2.3BDO改善了APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。在8月齡時(shí)，水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APP/PS1小鼠已經(jīng)具有明顯的學(xué)習(xí)和記憶損害。而經(jīng)過3BDO處理的轉(zhuǎn)基因小鼠，學(xué)習(xí)和記憶能力則明顯提升。相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組(3BDO)小鼠潛伏期明顯縮短，而探索實(shí)驗(yàn)中穿越平臺(tái)的次數(shù)和花在平臺(tái)所在象限的時(shí)間，均明顯增加。這提示3BDO治療可以明顯改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力缺陷。
　　 3.

9、3BDO治療明顯減少了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)淀粉樣斑塊的形成和可溶性Aβ的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，8月齡小鼠腦內(nèi)均觀察到了明顯的Aβ沉積。與對(duì)照組相比，3BDO治療后，明顯降低了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層的Aβ沉積。通過ELISA試劑盒定量檢測(cè)全腦可溶性Aβ的含量發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，治療組的Aβ40和Aβ42水平均明顯減少。這說明3BDO減少了APP/PS1小鼠腦內(nèi)的Aβ水平。
　　 4.自噬3BDO抑制了AP

10、P/PS1小鼠腦內(nèi)的自噬水平，而抑制自噬是經(jīng)由激活mTOR蛋白實(shí)現(xiàn)的。WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3BDO治療后，相對(duì)于對(duì)照組而言，LC3-Ⅱ的量明顯減少。與此相應(yīng)的是，自噬底物P62的含量則升高了。這表明長時(shí)間的3BDO治療抑制了APP/PS1小鼠腦內(nèi)的自噬流。通過檢測(cè)mTORCl磷酸化激活底物p70S6K(P70)的含量發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組（DMSO和NaCl），3BDO治療明顯增加了p70的含量，因此，這意味著3BDO是通過激活mTOR途徑而抑制

11、了自噬。通過透射電鏡計(jì)數(shù)神經(jīng)元內(nèi)自噬泡的含量，我們也發(fā)現(xiàn)，3BDO治療明顯減少了神經(jīng)元內(nèi)自噬泡的數(shù)量，改善了神經(jīng)元的功能。
　　 5.3BDO治療增加了轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)NEP和IDE的水平。3BDO治療后，APP/PS1小鼠腦內(nèi)的APP的表達(dá)量、β分泌酶BACE1的含量，以及β分泌酶剪切APP生成的C-末端產(chǎn)物，均沒有明顯改變。然而，兩個(gè)Aβ降解相關(guān)的酶，NEP和IDE，在3BDO治療后，均明顯增加了。而且NEP酶的活性增加也非常

12、明顯。這提示我們，3BDO治療后APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ含量的降低很可能是源于Aβ降解的增高所致。
　　 結(jié)論:
　　 綜上，我們?cè)诖诉M(jìn)一步探討了3BDO治療能否阻止或者延遲轉(zhuǎn)基因小鼠的AD進(jìn)展。我們發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間3BDO治療提高了Aβ降解酶IDE和NEP的含量，增加了NEP酶的活性，抑制了自噬水平（通過mTOR途徑），減少了腦內(nèi)Aβ的含量，改善了APP/PS1癡呆小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。而且，治療期間未見動(dòng)物死亡，說明3BD