基于P53-EGFR-STAT3信號通路探討加味芍藥甘草湯對子宮腺肌細胞增殖和遷移的干預(yù)機制.pdf

1、目的:
　　研究加味芍藥甘草湯通過介導(dǎo)miR-27a調(diào)控P53/EGFR/STAT3信號通路來治療子宮腺肌病的干預(yù)機制，從分子水平上闡釋加味芍藥苷草湯治療子宮腺肌病的深層機理，為進一步研究加味芍藥苷草湯有效作用部位和臨床優(yōu)化處方提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.選擇自2015年9月至2016年5月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院并接受手術(shù)治療的子宮腺肌病患者共10例，取其病灶組織進行細胞培養(yǎng)。
　　2.以免疫化

2、學(xué)法鑒定所培養(yǎng)的原代細胞;MTT法和流式細胞技術(shù)檢測細胞的增殖情況、細胞周期分布和凋亡率;劃痕實驗以檢測細胞的體外遷移能力;蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中p53-273H、LIF、EGFR、p-EGFR、c-Src、STAT3、p-STAT3、COX-2的表達;RT-qPCR技術(shù)檢測細胞中p53-273HmRNA、LIFRmRNA、miR-27a、EGFRmRNA的表達。
　　結(jié)果:
　　1.本研究共收

3、集了10例子宮腺肌病病灶組織，均培養(yǎng)成功。原代細胞培養(yǎng)24h后，其中的間質(zhì)細胞基本貼壁，呈梭形排列;腺上皮細胞則呈漩禍狀排列;平滑肌細胞呈長梭形或橢圓形，呈放射、平行排列。
　　2.經(jīng)免疫化學(xué)法（角蛋白、波形蛋白、平滑肌肌動蛋白）的鑒定，所培養(yǎng)的10例原代細胞為子宮腺肌細胞。
　　3.各組細胞在相應(yīng)藥物處理24h、48h后增殖抑制率(IR％)的情況為:加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組對子宮腺肌病病灶細胞的IR與陽性組和空白組相

4、比較具有顯著差異(P＜0.01)，且加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組對子宮腺肌病病灶細胞的IR與用藥時間呈正相關(guān)。
　　4.各組藥物作用24H、48H后，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細胞的凋亡率高于空白組，其中加味芍藥甘草湯高濃度組分別與陽性組(P＜0.05)和空白組(P＜0.01)相比較，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組處于G1/S期的細胞明顯高于空白組，P＜0.01其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.

5、各組藥物作用于人子宮腺肌細胞24h后，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細胞的遷移受到抑制，并且三組細胞均存在不同程度的形態(tài)學(xué)改變，如細胞體積變小、細胞皺縮、細胞間隙變大等;陽性對照組、空白組和基質(zhì)組的細胞向中間遷移。48h后，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組的細胞劃痕的距離進一步增大，而且這三組細胞的形態(tài)學(xué)變化更加明顯，其中加味芍藥甘草湯高濃度組出現(xiàn)部分漂浮的細胞;而陽性組的細胞則繼續(xù)向中間遷移、生長，空白組和部分基質(zhì)組的細胞則已完全愈合。

6、用Image J軟件測量24h和48h細胞遷移的距離，并計算所得劃痕愈合率顯示:加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組的細胞遷移率與空白組和陽性組細胞愈合率相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異意義(P＜0.05);加味芍藥甘草湯對子宮腺肌病痛灶細胞遷移力的抑制作用與中藥濃度和用藥時間呈正相關(guān)。
　　6.加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細胞中miR-27a基因的相對表達量較空白組高，24H和48H的加味芍藥甘草湯高濃度組與對應(yīng)空白組比較P＜0.05，其差異有

7、統(tǒng)計學(xué)意義;加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細胞中p53-273HmRNA、LIFRmRNA、miR-27a、EGFR mRNA的相對表達量較空白組低，24H和48H的加味芍藥甘草湯高濃度組與對應(yīng)空白組比較P＜0.05，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Spearman法檢驗miR-27a與p53-273HmRNA、LIFRmRNA、EGFR mRNA的相關(guān)性，結(jié)果顯示:miR-27a與p53-273HmRNA、LIFRmRNA和EGFR mRNA之

8、間存在明顯的負相關(guān)關(guān)系;p53-273HmRNA與LIFR mRNA、EGFR mRNA之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。
　　7.將各組藥物分別作用于人子宮腺肌細胞24h和48h后，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細胞的p53-273H、LIF、c-Src、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、COX-2蛋白表達較空白組均減弱。其中，24H加味芍藥甘草湯高濃度組與24H空白組比較P＜0.05，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義;48H加味芍