基于P53-EGFR-STAT3信號(hào)通路探討加味芍藥甘草湯對(duì)子宮腺肌細(xì)胞增殖和遷移的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　研究加味芍藥甘草湯通過(guò)介導(dǎo)miR-27a調(diào)控P53/EGFR/STAT3信號(hào)通路來(lái)治療子宮腺肌病的干預(yù)機(jī)制，從分子水平上闡釋加味芍藥苷草湯治療子宮腺肌病的深層機(jī)理，為進(jìn)一步研究加味芍藥苷草湯有效作用部位和臨床優(yōu)化處方提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.選擇自2015年9月至2016年5月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院并接受手術(shù)治療的子宮腺肌病患者共10例，取其病灶組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
　　2.以免疫化

2、學(xué)法鑒定所培養(yǎng)的原代細(xì)胞;MTT法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況、細(xì)胞周期分布和凋亡率;劃痕實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)細(xì)胞的體外遷移能力;蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞中p53-273H、LIF、EGFR、p-EGFR、c-Src、STAT3、p-STAT3、COX-2的表達(dá);RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中p53-273HmRNA、LIFRmRNA、miR-27a、EGFRmRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.本研究共收

3、集了10例子宮腺肌病病灶組織，均培養(yǎng)成功。原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后，其中的間質(zhì)細(xì)胞基本貼壁，呈梭形排列;腺上皮細(xì)胞則呈漩禍狀排列;平滑肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或橢圓形，呈放射、平行排列。
　　2.經(jīng)免疫化學(xué)法（角蛋白、波形蛋白、平滑肌肌動(dòng)蛋白）的鑒定，所培養(yǎng)的10例原代細(xì)胞為子宮腺肌細(xì)胞。
　　3.各組細(xì)胞在相應(yīng)藥物處理24h、48h后增殖抑制率(IR％)的情況為:加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組對(duì)子宮腺肌病病灶細(xì)胞的IR與陽(yáng)性組和空白組相

4、比較具有顯著差異(P＜0.01)，且加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組對(duì)子宮腺肌病病灶細(xì)胞的IR與用藥時(shí)間呈正相關(guān)。
　　4.各組藥物作用24H、48H后，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細(xì)胞的凋亡率高于空白組，其中加味芍藥甘草湯高濃度組分別與陽(yáng)性組(P＜0.05)和空白組(P＜0.01)相比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組處于G1/S期的細(xì)胞明顯高于空白組，P＜0.01其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.

5、各組藥物作用于人子宮腺肌細(xì)胞24h后，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細(xì)胞的遷移受到抑制，并且三組細(xì)胞均存在不同程度的形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞體積變小、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞間隙變大等;陽(yáng)性對(duì)照組、空白組和基質(zhì)組的細(xì)胞向中間遷移。48h后，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組的細(xì)胞劃痕的距離進(jìn)一步增大，而且這三組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化更加明顯，其中加味芍藥甘草湯高濃度組出現(xiàn)部分漂浮的細(xì)胞;而陽(yáng)性組的細(xì)胞則繼續(xù)向中間遷移、生長(zhǎng)，空白組和部分基質(zhì)組的細(xì)胞則已完全愈合。

6、用Image J軟件測(cè)量24h和48h細(xì)胞遷移的距離，并計(jì)算所得劃痕愈合率顯示:加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組的細(xì)胞遷移率與空白組和陽(yáng)性組細(xì)胞愈合率相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(P＜0.05);加味芍藥甘草湯對(duì)子宮腺肌病痛灶細(xì)胞遷移力的抑制作用與中藥濃度和用藥時(shí)間呈正相關(guān)。
　　6.加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細(xì)胞中miR-27a基因的相對(duì)表達(dá)量較空白組高，24H和48H的加味芍藥甘草湯高濃度組與對(duì)應(yīng)空白組比較P＜0.05，其差異有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細(xì)胞中p53-273HmRNA、LIFRmRNA、miR-27a、EGFR mRNA的相對(duì)表達(dá)量較空白組低，24H和48H的加味芍藥甘草湯高濃度組與對(duì)應(yīng)空白組比較P＜0.05，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Spearman法檢驗(yàn)miR-27a與p53-273HmRNA、LIFRmRNA、EGFR mRNA的相關(guān)性，結(jié)果顯示:miR-27a與p53-273HmRNA、LIFRmRNA和EGFR mRNA之

8、間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系;p53-273HmRNA與LIFR mRNA、EGFR mRNA之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。
　　7.將各組藥物分別作用于人子宮腺肌細(xì)胞24h和48h后，加味芍藥甘草湯高、中、低濃度組細(xì)胞的p53-273H、LIF、c-Src、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、COX-2蛋白表達(dá)較空白組均減弱。其中，24H加味芍藥甘草湯高濃度組與24H空白組比較P＜0.05，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;48H加味芍