SSAT通過AKT-GSK-3β-β-catenin信號通路抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全世界范圍內(nèi)與癌癥相關的最常見的死亡原因之一。通常情況下,肝癌患者早期沒有明顯癥狀,被診斷時多已發(fā)展到晚期階段,已不適合手術治療。因此,晚期肝癌治療方法的選擇受到了極大的限制。此外,由于術后復發(fā)率及轉移率較高,肝癌患者的五年存活率仍然不能令人滿意。因此,認識肝癌轉移的作用機制對肝癌的治療具有非常重要的指導意義。多胺是一類在哺乳動物細胞中含量豐富,參與細胞生長、分化

2、等生理過程且發(fā)揮關鍵作用的生物小分子,包括腐胺(Putrescine, PUT),亞精胺(Spermidine, SPD),以及精胺(Spermine, SPM)。已有大量文獻表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多胺的含量具有相關性。因此,多胺是一個十分有潛力的抗腫瘤靶點。精胺/亞精胺N1-乙酰轉移酶(Spermidine/spermine N1-acetyltransferase, SSAT)是真核細胞中多胺分解代謝的限速酶,是維持多胺濃度平衡的關鍵

3、酶。但是目前SSAT在肝癌中具體的生物學功能及作用機制仍然不清楚。
  目的:以3種肝癌細胞(SMMC7721、Hep G2、Bel7402)為實驗對象,探討SSAT對肝癌細胞的影響及其分子機制。
  方法:采用Western blotting實驗方法檢測3種肝癌細胞SMMC7721、Hep G2和Bel7402中 SSAT蛋白的表達情況;采用轉染的實驗方法構建 SSAT穩(wěn)定高表達的 SMMC7721、Hep G2細胞株,以

4、及SSAT敲減的Bel7402細胞株;使用高效液相色譜法檢測SSAT對肝癌細胞內(nèi)多胺含量的影響;使用 MTT和克隆形成實驗方法檢測 SSAT對肝癌細胞增殖和克隆形成能力的影響;使用傷口愈合實驗和鋪有Matrigel的Chamber transwell實驗檢測SSAT對肝癌細胞的遷移和侵襲能力的影響;使用Western blotting實驗檢測AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白的變化;使用高效液相色譜法檢測外加多胺對肝癌細胞

5、中多胺含量的改變,并使用Western blotting實驗檢測外加多胺是否影響AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白的變化;LiCl抑制 GSK-3β后,使用鋪有 Matrigel的Chamber transwell實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力,并使用Western blotting檢測β-catenin及下游蛋白的表達情況。
  結果:⑴Western blotting實驗結果發(fā)現(xiàn)SMMC7721、Hep G2中

6、SSAT表達含量較低,而Bel7402中較高。在此基礎上我們轉染并使用Western blotting驗證,成功構建了SSAT高表達的SMMC7721、Hep G2細胞株,以及SSAT敲減的Bel7402細胞株。HPLC實驗發(fā)現(xiàn) SSAT高表達可以顯著下調肝癌細胞中多胺的含量。而 SSAT敲減后,多胺含量上升;⑵MTT和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn) SSAT可以顯著抑制肝癌細胞的增殖和克隆形成能力;⑶傷口愈合實驗和鋪有Matrigel的Chambe

7、r transwell實驗發(fā)現(xiàn)SSAT可以抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力;⑷Western blotting實驗結果發(fā)現(xiàn)SSAT表達增加,AKT表達降低,且磷酸化減少。GSK-3β磷酸化也降低。而 SSAT表達下降,結果相反;進一步實驗發(fā)現(xiàn) SSAT高表達,β-catenin、Cyclin D1、以及N-cadherin蛋白表達下調,而E-cadherin上調;⑸外源性多胺作用后,SSAT高表達的SMMC7721、Hep G2細胞中多胺含

8、量上升,基本與未轉染SSAT的空白對照中多胺含量相當。Western blotting檢測結果表明AKT、GSK-3β以及β-catenin蛋白水平出現(xiàn)逆轉;⑹GSK-3β抑制劑 LiCl作用后,SSAT對細胞的抑制侵襲作用明顯降低。Western blotting的結果發(fā)現(xiàn)β-catenin的蛋白水平隨著 p-GSK-3β的升高而上調。
  結論:SSAT通過降低肝癌細胞中的多胺含量,經(jīng)由 AKT/GSK-3β/β-cateni

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