VEGF-C表達及基因多態(tài)性與胃癌的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分胃癌組織及血清VEGF-c表達與胃癌的相關(guān)性
　　背景:
　　胃癌(Gastric cancer，GC)是一種常見的消化道惡性腫瘤。病死率在所有惡性腫瘤中居第4位。近年來，隨著人們生活方式的和飲食習(xí)慣的改變，胃癌在我國的發(fā)病率迅速升高，并且患者具有年輕化的趨勢。因此，胃癌的防治仍是當(dāng)下重要的公共衛(wèi)生問題。胃癌是來源于腺體上皮的惡性腫瘤，即胃腺癌，占所有胃癌類型的95％以上。其主要轉(zhuǎn)移方式為淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。有研究表明:與

2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的早期胃癌相比，伴有周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期胃癌5年生存率明顯下降，二者具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。目前認(rèn)為，多種因素和復(fù)雜的步驟參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展。其中，新生的淋巴管和血管發(fā)揮重要作用。腫瘤的生長依賴于血液供應(yīng)，營養(yǎng)物質(zhì)通過血管參與了胃癌的生長、滲透和遠處血行轉(zhuǎn)移。淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌更常見的轉(zhuǎn)移方式。淋巴管散在地分布在腫瘤組織內(nèi)，其邊緣區(qū)域密度較高，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的解剖學(xué)基礎(chǔ)。新生的淋巴管結(jié)構(gòu)不完整，缺乏基底膜及平滑基層，

3、腫瘤細(xì)胞易進入淋巴管，產(chǎn)生淋巴轉(zhuǎn)移。因此，有效抑制淋巴管的新生可能是防止胃癌早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、改善預(yù)后的關(guān)鍵因素。血管及淋巴管的新生與血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)家族高度相關(guān)。當(dāng)胃癌發(fā)生時，VEGF的表達升高，直接參與了血管新生。而在胃癌組織中，VEGF-C的表達與淋巴管密度及周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間的關(guān)系尚不完全明確。除外腫瘤組織，血液循環(huán)中也有少量VEGF-C的存在，其濃度

4、大致反應(yīng)了腫瘤的生長及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況，血液中大部分VEGF-C是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生并釋放入血液。在胃癌患者中，血液中VEGF-C濃度的改變與胃癌的關(guān)聯(lián)性尚不明確。
　　目的:
　　本部分研究將通過檢測胃癌患者腫瘤組織中VEGF-C的表達情況，探究其與胃癌臨床病理學(xué)方面的關(guān)系;并通過檢測胃癌患者血清中VEGF-C的水平，比較胃癌手術(shù)前后血清VEGF-C濃度的改變，探究其濃度與臨床各項指標(biāo)的相關(guān)性，以期對臨床胃癌患者指導(dǎo)術(shù)前分期提

5、供參考依據(jù)。
　　方法:
　　收集144例胃癌患者、46例胃潰瘍患者（對照組）及120例健康人群清晨空腹外周血（胃癌和胃潰瘍患者在術(shù)前一天抽取），提取收集上層血清，放置于-80℃凍存留待檢測。手術(shù)中收取胃癌患者和胃潰瘍患者的胃組織標(biāo)本，保存于-80℃冰箱及RNAlater液中，分別用于蛋白質(zhì)水平和mRNA水平的檢測。
　　結(jié)果:
　　1.胃組織中VEGF-C的mRNA表達水平
　　在對照組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的

6、胃癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌組織中，三者VEGF-C的mRNA表達水平依次升高。無論是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，VEGF-C的mRNA表達水平在胃癌組均顯著高于對照組(P＜0.05)。其中，相比于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的胃癌組織，VEGF-C的mRNA水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌組織中升高更加顯著(P＜0.05)。
　　2.胃組織中VEGF-C的蛋白質(zhì)表達水平
　　對照組標(biāo)本中VEGF-C的蛋白質(zhì)相對表達水平最低，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的胃癌組織

7、和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌組織中，其蛋白質(zhì)相對表達水平依次升高，與對照組相比均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性胃癌組織中的VEGF-C蛋白質(zhì)表達水平顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的胃癌組織(P＜0.05)。該部分蛋白質(zhì)表達的結(jié)果與mRNA的結(jié)果具有高度一致性。
　　3.胃癌淋巴管密度(LVD)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性
　　我們進一步對胃癌組織中淋巴管密度和胃癌患者的臨床病理學(xué)特征進行了相關(guān)性分析。TNM分期在Ⅰ、Ⅱ

8、期的患者，其淋巴管的密度顯著低于Ⅲ、Ⅳ期的患者(5.02±2.71 vs.13.55±3.11，P＜0.05);合并周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其淋巴管密度顯著高于周圍淋巴結(jié)陰性的患者(13.21±3.05 vs.5.17±2.96,P＜0.05);對于腫瘤的分化等級，在中高分化和低分化患者中，淋巴管密度未見顯著差別(6.22±3.13 vs.7.84±3.18，P＞0.05)。該結(jié)果說明胃癌組織局部淋巴管密度可能與周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。<

9、br>　　4.胃癌微血管密度(MVD)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性
　　與淋巴管密度和胃癌相關(guān)性分析類似，我們使用同樣的方法統(tǒng)計了微血管密度和胃癌患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn):TNM分期在Ⅰ、Ⅱ期的患者，其微血管密度顯著低于Ⅲ、Ⅳ期的患者(5.27±2.65 vs.12.41±1.98，P＜0.05);合并周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其微血管密度顯著高于周圍淋巴結(jié)陰性的患者(12.42±4.76 vs.7.62±3.12，P＜0.0

10、5);對于腫瘤的分化等級，在中高分化和低分化患者中，微血管密度未見顯著差別(6.59±1.98 vs.6.92±2.56，P＞0.05)。該結(jié)果與淋巴管密度的結(jié)果具有一致性。
　　5.VEGF-C與胃癌臨床特征的相關(guān)性
　　無論是VEGF-C的mRNA還是蛋白表達水平，均與病人的性別、年齡和組織學(xué)分化程度無關(guān)(P＞0.05)，而與患者的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)。本部分結(jié)果顯示，在VEGF-C mRNA及蛋白

11、質(zhì)表達水平較高的患者，其組織學(xué)分化水平更差，周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性更高。
　　6.VEGF-C與微血管密度及淋巴管密度的相關(guān)性
　　我們進一步分析了VEGF-C在mRNA和蛋白質(zhì)兩個水平表達量與胃癌組織微血管密度及淋巴管密度的相關(guān)性。結(jié)果顯示在胃癌組織中微血管密度及淋巴管密度與VEGF-C的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平均具有正相關(guān)性(P＜0.05)。
　　7.健康人群、胃潰瘍對照組和胃癌患者術(shù)前組血清VEGF-C水平比較<

12、br>　　為了進一步明確VEGF-C與胃癌臨床病理學(xué)的關(guān)系，我們針對血清中的VEGF-C進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在健康人群、胃潰瘍患者及胃癌患者術(shù)前血清中VEGF-C濃度分別為(116.80±26.92) pg/ml、(130.64±20.16) pg/ml和(389.68±160.70) pg/ml。與健康人群和胃潰瘍患者相比，胃癌患者血清中VEGF-C濃度明顯增高(P＜0.05)，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異;而健康人群和胃潰瘍患者間相比無顯著統(tǒng)

13、計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　8.胃癌患者術(shù)前血清VEGF-C水平與胃癌臨床特征間的關(guān)聯(lián)
　　(1)性別
　　比較男性胃癌患者和女性胃癌患者的血清VEGF-C水平，二者分別為(382.61±144.83) pg/ml和(428.65±158.36) pg/ml，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)兩者無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(2)年齡
　　以60歲為界，比較不同年齡段胃癌患者血清內(nèi)VEGF-C水平的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

14、:小于60歲胃癌患者血清VEGF-C的濃度為(390.63±152.17) pg/ml;大于等于60歲胃癌患者為(406.12±150.24)pg/ml，兩者相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(3)TNM分期
　　檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著TNM分期的進展，血清內(nèi)VEGF-C水平顯著升高，Ⅰ期、Ⅱ期患者與Ⅲ期、Ⅳ期患者血清VEGF-C濃度分別為(257.73±72.14) pg/ml和(532.42±121.86) pg/

15、ml，兩者相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　(4)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
　　有周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者血清VEGF-C濃度為(513.86±182.06) pg/ml，顯著高于無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(360.14±136.56) pg/ml，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　(5)分化等級
　　結(jié)果顯示:血清VEGF-C水平在中高分化胃癌組為(337.26±130.06) pg/ml，在低分化胃癌組為(429.68

16、±178.80) pg/ml，二者間具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　9.血清VEGF-C濃度在胃癌手術(shù)前后的變化
　　在所有亞組中，胃癌術(shù)后患者血清中VEGF-C濃度均顯著下降，與術(shù)前相比均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。該結(jié)果說明，胃癌患者術(shù)前血清中高濃度的VEGF-C可能主要來源于腫瘤組織。
　　結(jié)論:
　　胃癌組織中VEGF-C的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。VEGF-C可能通過腫瘤血管生成和淋巴管

17、新生參與了胃癌的進展過程，抑制VEGF-C的活性或可減緩腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，起到抗腫瘤的治療效果。血清中VEGF-C的水平可以作為反映腫瘤進展和手術(shù)預(yù)后的有效指標(biāo)，或可被用于術(shù)前評估胃癌患者病情及術(shù)后監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)，在指導(dǎo)優(yōu)化臨床治療方案方面具有潛在利用價值。
　　第二部分 VEGF-C基因多態(tài)性與胃癌的相關(guān)性
　　背景:
　　基因變異是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的因素之一。其中，單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide po

18、lymorphism，SNP）是人類可遺傳變異中最常見的一種，并且與某些類型腫瘤的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。SNP指的是在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP在人類基因組中廣泛存在，并且在腫瘤研究領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。SNP根據(jù)其是否在蛋白編碼區(qū)域分為編碼區(qū)SNP和非編碼區(qū)SNP，部分位于編碼區(qū)的SNP可以引起編碼蛋白中氨基酸的改變，從而起到致癌作用。在第一部分研究中我們發(fā)現(xiàn)，胃癌組織及血清中VEGF-C的濃度明顯上升，

19、并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、微血管密度(MVD)及淋巴管密度(LVD)相關(guān)。然而，VEGF-C表達上升的具體機制尚不明確，推測可能與VEGF-C的基因多態(tài)性有關(guān)。目前，超過60個SNP位點在VEGF-C基因中被發(fā)現(xiàn)，部分位點與疾病的發(fā)生相關(guān)。例如，VEGF-C多態(tài)性位點rs1485766 A/A型的人群患肝細(xì)胞肝癌的風(fēng)險增高，說明該多態(tài)性位點可以在一定程度上預(yù)測腫瘤的發(fā)生。目前，尚沒有VEGF-C基因單核苷酸多態(tài)性與胃癌相關(guān)性的報道。
　　

20、目的:
　　本部分研究以胃癌患者（病例組）及健康人群（對照組）為研究對象，通過對VEGF-C基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)進行測序，探索VEGF-C基因SNP與胃癌間的關(guān)聯(lián)性。為胃癌病因?qū)W研究及臨床指導(dǎo)提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　采集胃癌患者（病例組，144例）及健康人群（對照組，120例）外周血樣本，提取外周血液DNA，設(shè)計VEGF-C基因引物，進行預(yù)實驗驗證后使用。對VEGF-C基因外顯子區(qū)域和已知的3個內(nèi)含子區(qū)域的S

21、NP位點進行基因測序。將兩組數(shù)據(jù)進行序列對比，使用SPSS16.0軟件對比分析兩組測序發(fā)現(xiàn)的SNP位點基因型和基因頻率。
　　結(jié)果:
　　通過對胃癌患者和健康人群VEGF-C基因測序，我們在外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了3個已知的SNP位點，分別為位于1號外顯子的rs535702112，位于4號外顯子的rs772765057和位于6號外顯子的rs766890973，均屬于同義單核苷酸堿基改變。3個位于內(nèi)含子區(qū)域的SNP分別是rs14857

22、66、rs11947611和rs7664413。病例組和對照組之間基因多態(tài)性的基因型和相關(guān)性見表1。我們分別分析了這6個SNP位點的基因型頻率和等位基因頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病例組與對照組相比均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　rs535702112、 rs772765057、 rs766890973、 rs1485766、 rs11947611和rs7664413位點在病例組和對照組等位基因頻率最高的堿基對分別為:純合子GG，純合子GG，雜合子T

23、C，純合子AA，純合子CC，純合子CC。通過綜合變量分析，相比于對照組，胃癌患者病例組中帶有以上各個SNP位點并無明顯意義。
　　在本部分研究中，我們根據(jù)不同的臨床指標(biāo)將胃癌患者分為3個亞組，包括TNM臨床分期、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度，然后通過分別對比各個亞組與正常人群SNP等位基因的頻率，研究VEGF-C基因多態(tài)性對胃癌病理學(xué)特征的影響。結(jié)果顯示，對照組與病例組相比，多態(tài)性位點rs535702112，rs772765057