EPA抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種惡性度非常高的實(shí)體腫瘤，侵襲轉(zhuǎn)移是其惡化發(fā)展的重要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致肝癌患者死亡的最主要原因。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多種因素、多機(jī)制參與的共同調(diào)控進(jìn)程，現(xiàn)已證實(shí)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial mesenchymal transition，EMT）是影響肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程的重要分子機(jī)制之一。端粒酶作為影響肝癌發(fā)展進(jìn)程的關(guān)鍵性機(jī)

2、制酶，它的活性直接受端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Human telomerase reverse transcriptase，hTERT）調(diào)控，hTERT作為維持端粒結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)鍵性分子，最近研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。二十碳五烯酸（EPA）是n-3多不飽和脂肪酸的一員，前期研究發(fā)現(xiàn)其能夠抑制多種惡性腫瘤的進(jìn)展，但現(xiàn)今對(duì)其抗癌效用的作用機(jī)制還不明確，尤其是EPA對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響目前還未見(jiàn)報(bào)道。
　　研究目的：<

3、br>　　1.明確EPA對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響；2.EPA能否逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞EMT；3.EPA能否影響EMT介導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移；4.探討hTERT在EPA影響EMT進(jìn)程中的作用。
　　第一部分 EPA對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　不同濃度EPA(0、25、50、100、200、300、400μM)與TGF-β1（10 ng/m

4、l）共同干預(yù)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖與凋亡變化。
　　研究方法：
　　1.倒置顯微鏡下觀察SMMC-7721肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)；2.MTT檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖率；3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) SMMC-7721肝癌細(xì)胞凋亡；4.Western檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.顯微鏡下初步觀察到EPA對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞

5、具有生長(zhǎng)抑制效果；2.MTT檢測(cè)結(jié)果證實(shí)EPA干預(yù)后SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖率逐漸降低，且呈現(xiàn)出時(shí)間濃度依賴性；3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示EPA干預(yù)48 h后SMMC-7721肝癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，且凋亡率與EPA濃度呈正相關(guān)；4.Western結(jié)果表明EPA干預(yù)48 h后SMMC-7721肝癌細(xì)胞促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)而能夠下調(diào)抗凋亡Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　EPA能夠抑制 SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖

6、并促使其凋亡，且抑制效果具有時(shí)間濃度依賴性。
　　第二部分 EPA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　10 ng/ml TGF-β1刺激SMMC-7721肝癌細(xì)胞，誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。用50μM、200μM EPA干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞檢測(cè)其侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化。
　　研究方法：
　　1.倒置顯微鏡下觀察人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞

7、形態(tài)的改變；2.Western檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)；3.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞遷移率；4.Transwell檢測(cè) SMMC-7721肝癌細(xì)胞侵襲率；5.ELISA檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.顯微鏡下初步觀察到 EPA能夠抑制 TGF-β1誘導(dǎo)的 SMMC-7721肝癌細(xì)胞EMT；2.Wester

8、n結(jié)果驗(yàn)證了EPA能夠逆轉(zhuǎn) TGF-β1誘導(dǎo)的 SMMC-7721肝癌細(xì)胞EMT；3.劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)EPA能夠明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞的遷移能力，且抑制效果存在時(shí)間濃度依賴；4.Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí) EPA能夠明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞的侵襲能力，且抑制效果也存在時(shí)間濃度依賴；5.ELISA檢測(cè)結(jié)果表明EPA能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶M

9、MP-2和MMP-9。
　　結(jié)論：
　　10 ng/ml TGF-β1能夠誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。EPA可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的EMT，并抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9的分泌從而降低其侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　第三部分 EPA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞端粒酶活性的影響
　　50μM、200μM EPA作用于TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞，檢測(cè)S

10、MMC-7721肝癌細(xì)胞端粒酶的活性及端粒酶調(diào)控蛋白hTERT的表達(dá)。
　　研究方法：
　　1.ELISA檢測(cè)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞端粒酶活性；2.Western檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞hTERT蛋白表達(dá)；3.Real-time PCR檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)；4.細(xì)胞免疫熒光法觀察SMMC-7721肝癌細(xì)胞hTERT熒光強(qiáng)度。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.EPA能夠抑制TG

11、F-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞的端粒酶活性，且抑制效果具有時(shí)間濃度依賴性；2.EPA能夠明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞hTERT蛋白表達(dá)；3.EPA能夠明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)；4.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示EPA能夠降低TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞hTERT熒光強(qiáng)度。
　　結(jié)論：
　　EPA能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SMMC-77