非梗阻性無(wú)精子癥患者接受供精人工授精治療的影響因素分析及精漿分子標(biāo)記物研究.pdf

1、目的:回顧性分析非梗阻性無(wú)精子癥(non-obstructive azoospermia，NOA)患者的3880個(gè)供精人工授精(artificial insemination with donor sperm，AID)治療周期，探討可能影響AID臨床妊娠率的相關(guān)因素，以期進(jìn)一步提高AID助孕技術(shù)的成功率。對(duì)這些NOA患者的精漿miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選與NOA相關(guān)的精漿分子標(biāo)記物，為NOA的診斷和治療手段的選擇提供思路。
　

2、　方法:1.回顧性分析2010年1月至2016年12月因男方NOA于國(guó)家衛(wèi)計(jì)委科研所計(jì)劃生育生殖健康技術(shù)服務(wù)中心接受AID手術(shù)治療的患者2030例，共3880個(gè)治療周期。探討AID臨床妊娠率與女方年齡、不孕年限、不孕類型、治療周期數(shù)、治療方案、手術(shù)方式、精液參數(shù)等因素的關(guān)系。首先采用單因素Logistic回歸計(jì)算各變量比值比(OR)和95％置信區(qū)間(95％CI)，再將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)變量納入到多因素Logistic回歸模型中

3、，探討可能影響AID妊娠結(jié)局的因素。2.針對(duì)有病理分型的部分接受AID治療的NOA患者，按照睪丸病理組織類型分為唯支持細(xì)胞綜合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)組和生精阻滯(spermatogenesis arrest，SA)組，以1年內(nèi)配偶懷孕并正常分娩的男性作為正常對(duì)照組，樣本數(shù)分別為SCOS組7例，SA組6例和正常對(duì)照組3例。利用Illumina HiSeq X10高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)各組精漿miRN

4、As的表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)序分析，獲得不同睪丸病理組織類型NOA患者的精漿miRNAs表達(dá)譜，并對(duì)全部miRNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)組間差異顯著的miRNAs的靶基因進(jìn)行功能注釋和富集分析。3.使用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-34c-5p和miR-202-3p這兩個(gè)與精子發(fā)生相關(guān)的睪丸特異性差異miRNAs在接受AID治療的NOA患者精漿中的表達(dá)，SCOS組、SA組和正常對(duì)照組每組各10例樣本。4.使用qRT-PCR方法對(duì)預(yù)測(cè)的富集在NOT

5、CH信號(hào)通路上的差異miNRAs的靶基因Hes5在接受AID治療的NOA患者精漿中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，SCOS組、SA組和正常對(duì)照組每組各5例樣本。
　　結(jié)果:AID臨床妊娠915人，累積臨床妊娠率45.1％，周期臨床妊娠率23.58％，流產(chǎn)96人(10.5％)，單胎妊娠781人(85.4％），多胎妊娠38人(4.1％)，截止2016年12月的分娩數(shù)為683個(gè)，其中活嬰分娩數(shù)680個(gè)(99.56％)，出生缺陷4例(0.59％)。AID

6、臨床妊娠率影響因素分析:(1)年齡與妊娠率呈負(fù)相關(guān);(2)繼發(fā)不孕婦女妊娠的幾率比原發(fā)不孕婦女高;(3)手術(shù)方式為1次宮頸管內(nèi)人工授精(ICI)的妊娠率最低，其他三種手術(shù)方式妊娠率與1次ICI相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(4)促排并不增加AID妊娠率但會(huì)增加多胎率;(5)AID治療周期數(shù)、不孕年限、前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)(processed total motile sperm count，PTMS)和精子濃度等精液參數(shù)與AID妊娠率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)

7、性;NOA患者精漿分子標(biāo)記物研究:(1)不同睪丸病理組織類型NOA患者的精漿miRNAs表達(dá)差異研究:①所有樣品共預(yù)測(cè)出3107個(gè)miRNAs，其中已知miRNAs1667個(gè)，新預(yù)測(cè)miRNAs1440個(gè);②miRNAs差異表達(dá)分析結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，SCOS組有78種差異表達(dá)的miRNAs，其中4種miRNAs表達(dá)上調(diào)，74種miRNAs表達(dá)下調(diào);SA組有35種差異表達(dá)的miRNAs，其中3種miRNAs表達(dá)上調(diào)，32種miRN

8、As表達(dá)下調(diào);SCOS組精漿miRNAs表達(dá)譜與SA組相比，9種miRNAs表達(dá)上調(diào)，沒有下調(diào)的差異miRNAs;③聚類分析結(jié)果顯示不同組間精漿miRNAs表達(dá)譜可以明顯區(qū)分;④全部miRNAs共預(yù)測(cè)到19669個(gè)靶基因，有19651個(gè)獲得注釋信息。對(duì)這些注釋的靶基因行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)受差異miRNAs調(diào)控的靶基因參與的代謝通路中富集程度最高的是NOTCH信號(hào)通路。(2)精漿差異miRNAs的驗(yàn)證及NOA可能

9、分子機(jī)制探討:qRT-PCR結(jié)果顯示miR-34c-5p和miR-202-3p這兩個(gè)睪丸特異性差異miRNAs在NOA的兩組精漿中的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于正常對(duì)照組，且SCOS組精漿中的表達(dá)量比SA組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);NOTCH信號(hào)通路上的差異miRNAs靶基因Hes5在SA組精漿中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論:AID是一種安全、有效的助孕方式。女方年齡是影響AID

10、臨床妊娠率的最重要因素;不孕類型、手術(shù)方式也是AID臨床妊娠率的重要影響因素;促排卵并不增加AID妊娠率，但會(huì)增加多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn);IUI處理前、處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)和精子濃度與AID臨床妊娠率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;精液常規(guī)分析合格的供精者精液實(shí)際的臨床累積妊娠率卻有明顯差異。不同睪丸病理組織類型NOA患者的精漿miRNAs表達(dá)譜不同;多個(gè)差異miRNAs的靶基因富集在NOTCH信號(hào)通路上，靶基因Hes5在NOA患者精漿中的表達(dá)明顯升高;精漿m