非梗阻性無(wú)精少精癥主要遺傳因素的快速檢測(cè)新方法研究.pdf

1、研究目的:建立一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time PCR)平臺(tái)的檢測(cè)新技術(shù)，能夠在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)快速準(zhǔn)確地同時(shí)檢測(cè)克氏綜合征與Y染色體微缺失。從而建立一種廉價(jià)、易行、高通量的針對(duì)非梗阻性無(wú)精少精癥的主要遺傳因素檢測(cè)新方法，為男性不育的科學(xué)治療與預(yù)后提供有效的指導(dǎo)工具。以多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在克氏綜合征與Y染色體微缺失檢測(cè)中的臨床應(yīng)用評(píng)估。并探討廈門(mén)地區(qū)克氏綜合征與Y染色體微缺失發(fā)病情況。
　　研究方法:分別針對(duì)Y染色體上Z

2、FY、AZFa、AZFb、AZFc四個(gè)區(qū)域內(nèi)的目標(biāo)序列設(shè)計(jì)四對(duì)檢測(cè)引物與對(duì)應(yīng)的四條檢測(cè)探針。四條探針?lè)謩e采用FAM、HEX、ROX和CY5熒光基團(tuán)標(biāo)記，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，建立可在單一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)克氏綜合征與Y染色體微缺失進(jìn)行雙重驗(yàn)證的四重PCR反應(yīng)體系。應(yīng)用多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，對(duì)1624例就診我院的非梗阻性無(wú)精少精癥患者，進(jìn)行克氏綜合征以及AZFa，AZFb，AZFc區(qū)共六個(gè)序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS)的微缺失分析，結(jié)果與對(duì)照方法進(jìn)

3、行比較。
　　研究結(jié)果:成功建立檢測(cè)克氏綜合征與Y染色體微缺失的四重PCR反應(yīng)體系。同時(shí)它們均具有高診斷率及良好的靈敏度和特異性。在克氏綜合征(47，XXY)和正常男性(46，XY)的模板DNA在2ng到100ng之間時(shí)，NRP值是無(wú)重疊的。因此，檢測(cè)47，XXY的四重試驗(yàn)法，對(duì)基因組DNA模板量應(yīng)用范圍較寬，其檢測(cè)最低量為2 ng。此外，我們發(fā)現(xiàn)25ng的DNA是檢測(cè)克氏綜合征的最佳模板量。以多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)克氏綜合征

4、的患病率為3.33％;Y染色體微缺失的患病率為5.23％。在AZF缺失的各類型比較中，以AZFc區(qū)微缺失占的比例最高為61.18％，其次為AZFb+c區(qū)微缺失占的比例為22.35％。
　　研究結(jié)論:我們構(gòu)建的克氏綜合征和Y染色體微缺失與四重PCR結(jié)合的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)的特點(diǎn)。能避免瓊脂糖凝膠電泳分析方法所遇到的PCR產(chǎn)物的污染，同時(shí)與現(xiàn)有的分子的方法，如染色體微數(shù)組分析(CMA)，下一代測(cè)序(NGS)，熒光定量PC