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文檔簡介
1、研究目的:建立一種基于實時熒光PCR(Real-time PCR)平臺的檢測新技術(shù),能夠在一個反應(yīng)管內(nèi)快速準(zhǔn)確地同時檢測克氏綜合征與Y染色體微缺失。從而建立一種廉價、易行、高通量的針對非梗阻性無精少精癥的主要遺傳因素檢測新方法,為男性不育的科學(xué)治療與預(yù)后提供有效的指導(dǎo)工具。以多重實時熒光PCR技術(shù)在克氏綜合征與Y染色體微缺失檢測中的臨床應(yīng)用評估。并探討廈門地區(qū)克氏綜合征與Y染色體微缺失發(fā)病情況。
研究方法:分別針對Y染色體上Z
2、FY、AZFa、AZFb、AZFc四個區(qū)域內(nèi)的目標(biāo)序列設(shè)計四對檢測引物與對應(yīng)的四條檢測探針。四條探針分別采用FAM、HEX、ROX和CY5熒光基團(tuán)標(biāo)記,通過實時PCR反應(yīng),建立可在單一個反應(yīng)管內(nèi)同時對克氏綜合征與Y染色體微缺失進(jìn)行雙重驗證的四重PCR反應(yīng)體系。應(yīng)用多重實時熒光PCR技術(shù),對1624例就診我院的非梗阻性無精少精癥患者,進(jìn)行克氏綜合征以及AZFa,AZFb,AZFc區(qū)共六個序列標(biāo)記位點(STS)的微缺失分析,結(jié)果與對照方法進(jìn)
3、行比較。
研究結(jié)果:成功建立檢測克氏綜合征與Y染色體微缺失的四重PCR反應(yīng)體系。同時它們均具有高診斷率及良好的靈敏度和特異性。在克氏綜合征(47,XXY)和正常男性(46,XY)的模板DNA在2ng到100ng之間時,NRP值是無重疊的。因此,檢測47,XXY的四重試驗法,對基因組DNA模板量應(yīng)用范圍較寬,其檢測最低量為2 ng。此外,我們發(fā)現(xiàn)25ng的DNA是檢測克氏綜合征的最佳模板量。以多重實時熒光PCR技術(shù)檢測克氏綜合征
4、的患病率為3.33%;Y染色體微缺失的患病率為5.23%。在AZF缺失的各類型比較中,以AZFc區(qū)微缺失占的比例最高為61.18%,其次為AZFb+c區(qū)微缺失占的比例為22.35%。
研究結(jié)論:我們構(gòu)建的克氏綜合征和Y染色體微缺失與四重PCR結(jié)合的檢測方法,實現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確、廉價的特點。能避免瓊脂糖凝膠電泳分析方法所遇到的PCR產(chǎn)物的污染,同時與現(xiàn)有的分子的方法,如染色體微數(shù)組分析(CMA),下一代測序(NGS),熒光定量PC
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