疏綿狀嗜熱絲孢菌突變體的篩選及蛋白激酶基因的過量表達(dá).pdf

1、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一種廣泛分布的嗜熱真菌，是真核生物中生長上限溫度最高的一種真菌，從該菌中已分離了多種嗜熱酶，并進(jìn)行了真核表達(dá)，使得該菌種在工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和微生物研究中的作用越來越大。目前，對該嗜熱菌感受和傳導(dǎo)信號的機制尚不清楚。蛋白激酶基因pspk是我們從疏綿狀嗜熱絲孢菌中分離得到的一種新的蛋白激酶基因，其具體的功能尚需進(jìn)行研究分析。通過遺傳轉(zhuǎn)化，向菌株基因組隨機插入外源質(zhì)粒DNA，構(gòu)建

2、該菌的突變體，對探索該菌的嗜熱性機制具有重要意義。
　　本實驗室利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法已成功建立了疏綿狀嗜熱絲孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為研究基因的功能，分離功能基因提供了重要的手段，也為外源基因在其體內(nèi)的表達(dá)提供了有效地途徑。另外，利用亞細(xì)胞定位的方法，將該基因與GFP基因的融合表達(dá)載體pROKⅡ-GFP-pspk轉(zhuǎn)化至洋蔥表皮細(xì)胞并使其進(jìn)行表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光出現(xiàn)在細(xì)胞核的位置，推測該蛋白激酶在洋蔥表皮亞細(xì)胞定位的部位

3、為細(xì)胞核。首先利用已成功構(gòu)建的疏綿狀嗜熱絲孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法篩選大量突變體，獲得多株表型各異的突變體。這些突變體在菌落形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢量等方面與野生菌株具有明顯差異。這就為研究基因的功能，分離功能基因提供了材料，為探索該嗜熱菌的耐熱機制提供材料。本實驗以疏綿狀嗜熱絲孢菌蛋白激酶為研究對象，構(gòu)建了其表達(dá)載體pROKⅡ-hph-pspk，并對本實驗室已成功構(gòu)建的疏綿狀嗜熱絲孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。最終確定農(nóng)桿菌菌株LB

4、A4404在孢子萌發(fā)4.5h，孢子濃度為5×106個/皿，共培養(yǎng)時AS濃度為250μmol/L時，表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高。利用熒光定量技術(shù)，確定蛋白激酶基因pspk在轉(zhuǎn)化菌株中的表達(dá)量是野生菌株的1.729倍，證明獲得了蛋白激酶基因的過量表達(dá)的菌株。對得到的過量表達(dá)菌株進(jìn)行生物表型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)的菌株具有一致的生物表型特征，且其耐熱性比野生菌株明顯降低。通過以上研究初步推測蛋白激酶基因pspk可能與菌體的耐熱功能相關(guān)，有助于