XRCC5-p300相互作用上調(diào)環(huán)氧化酶-2促進(jìn)結(jié)腸癌生長的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率位居男性惡性腫瘤的第三位及女性惡性腫瘤的第二位。全球男性CRC每年新發(fā)病例高達(dá)近75萬，每年約37萬男性死于CRC，CRC死亡率居男性癌癥死亡率第四位。全球女性CRC每年新發(fā)病例高達(dá)61萬，每年32萬女性死于CRC，CRC死亡率居女性癌癥死亡率第三位。CRC已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病，受到各國衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的重視。目前只有早期發(fā)現(xiàn)及根治性結(jié)直腸癌手術(shù)可以

2、治愈該病。然而，一部分CRC患者在首次就診時已伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，處于結(jié)直腸癌晚期，無法手術(shù)根治。晚期CRC的治療方法包括局部放療、全身化療、中醫(yī)藥治療及靶向藥物治療。局部放療及全身化療副作用大，而且療效有限。目前常用的CRC化療方案為5-氟尿嘧啶、依立替康、甲酰四氫葉酸、奧沙利鉑、卡培他濱組成的聯(lián)合化療方案。在全身化療治療過程中CRC常出現(xiàn)耐藥，并導(dǎo)致治療失敗。隨著對CRC發(fā)病機(jī)制研究的深入，多種CRC治療靶點被發(fā)現(xiàn)。靶向藥物治療已成為新的

3、有前途的腫瘤治療方法，具有精準(zhǔn)、安全及損傷小等特點，逐步成為晚期CRC治療的理想選擇方案，并可以作為化療的聯(lián)合方案。血管內(nèi)皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）抑制劑貝伐珠單抗及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑西妥昔單抗已被成功用于晚期CRC的治療。然而，CRC的發(fā)生及發(fā)展是多信號通路的，阻斷單一信號通路

4、后腫瘤其他信號通路常發(fā)生代償，貝伐珠單抗及西妥昔單抗治療的CRC患者中仍然存在腫瘤耐藥發(fā)生。研究CRC其他的信號通路不僅有利于進(jìn)一步明確CRC發(fā)病機(jī)制，而且有助于發(fā)現(xiàn)新的晚期CRC治療靶點。如果能將新的靶向藥物應(yīng)用于臨床將有助于進(jìn)一步改善CRC患者的預(yù)后。
　　環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）是前列腺素(prostaglandins，PG)合成的限速酶，COX將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGG2，PGG2進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為PGH

5、2，PGH2進(jìn)而生成具有生物活性的PG（PGE2、PGD2和血栓素A2等），在炎癥、應(yīng)激及消化道黏膜保護(hù)等生理過程中發(fā)揮重要作用。在生物體內(nèi)，COX存在COX-1、COX-2、及COX3三種同工酶。COX-1為結(jié)構(gòu)性酶，主要存在于血管、胃和腎等組織中，參與胃黏膜保護(hù)、血流調(diào)節(jié)及血小板聚集調(diào)節(jié)等生理功能。COX-3為COX-1的剪接變異體，目前其功能尚不清楚。與COX-1結(jié)構(gòu)性表達(dá)不同，COX-2在組織損傷及炎癥時表達(dá)增加，COX-2是典

6、型的誘導(dǎo)型COX。研究發(fā)現(xiàn)超過50%的腫瘤組織COX-2高表達(dá)，這表明COX-2在腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用，是重要的促腫瘤因子。
　　COX-2的產(chǎn)物PGE2通過G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR）家族的EP1、EP2、EP3、 EP4及過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）作用于細(xì)胞膜，進(jìn)而將信號

7、傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。研究表明，PGE2通過EP4激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。PGE2還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長。PGE2也可以誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，并增加核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（

8、nuclear factor kappa B，NF-ΚB）活性，進(jìn)而抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。同時，COX-2還具有促進(jìn)血管生成的作用。COX-2誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），VEGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，進(jìn)而促進(jìn)血管生成。還有研究表明，COX-2通過調(diào)控EP4介導(dǎo)的NOTCH/WNT通路誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞發(fā)生。腫瘤微環(huán)境的免疫功能常常發(fā)生由Th1主導(dǎo)的免疫

9、反應(yīng)向由Th2主導(dǎo)的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)換。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白介素-2（interleukin-2，IL-2）可以促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖，而白介素-4（interleukin-4，IL-4）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）促進(jìn)Th2細(xì)胞增殖。COX-2通過PG

10、E2下調(diào)腫瘤細(xì)胞TNF-α、IFN-γ和IL-2表達(dá)，并上調(diào)腫瘤細(xì)胞IL-4、IL-6和IL-10表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤微環(huán)境免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)換，使腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)控?？梢?，COX-2可以通過促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞形成及促進(jìn)腫瘤免疫逃避促進(jìn)腫瘤發(fā)生，COX-2是重要的促腫瘤因子，可以作為腫瘤治療靶點。
　　X線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白5（X-ray repair cross-complementing protein5，XRCC5

11、）亦稱為Ku80，由XRCC5基因編碼，與XRCC6共同構(gòu)成XRCC5/XRCC6異源二聚體，是一種DNA依賴性蛋白激酶復(fù)合物（DNA-dependent protein kinase complex，DNA-PK）。XRCC5基因位于2q33-34，編碼732個氨基酸，XRCC5蛋白分子質(zhì)量約為86kDa。研究證實，XRCC5蛋白參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)和重組，維持染色體及基因組穩(wěn)定性。XRCC5/XRCC6二聚體可以結(jié)合DNA雙鏈斷裂

12、末端，是DNA非同源末端連接修復(fù)的必要組分。研究還表明，XRCC5的功能并不局限于DNA雙鏈斷裂修復(fù)，XRCC5還可以作為粘附因子，參與腫瘤細(xì)胞的粘附、遷移及侵襲。XRCC5在多種腫瘤組織中高表達(dá)（包括結(jié)直腸癌），這表明XRCC5也是一種促癌因子，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。既往研究表明，XRCC5可以通過與CBP協(xié)同作用增加COX-2表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。然而，XRCC5與COX-2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用及其機(jī)制尚不明確。
　　

13、本研究通過生物素-鏈霉親和素垂釣實驗尋找并鑒定結(jié)腸癌細(xì)胞中COX-2表達(dá)調(diào)控中未知的且必須的轉(zhuǎn)錄因子時，發(fā)現(xiàn)XRCC5能夠特異性地結(jié)合在COX-2啟動子上，進(jìn)而激活COX-2轉(zhuǎn)錄，上調(diào)COX-2表達(dá)。通過調(diào)控XRCC5在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，驗證XRCC5對COX-2的調(diào)控作用。通過細(xì)胞增殖實驗及動物成瘤實驗驗證XRCC5通過COX-2影響結(jié)腸癌生長。為進(jìn)一步明確XRCC5調(diào)控COX-2的機(jī)制，我們通過進(jìn)一步的免疫共沉淀實驗還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄共活

14、化子p300參與XRCC5調(diào)控COX-2的表達(dá)過程。而后，我們還驗證了p300通過調(diào)控XRCC5乙?；竭M(jìn)而調(diào)控COX-2表達(dá)的機(jī)制。我們的研究闡明了XRCC5及p300協(xié)同調(diào)控COX-2促進(jìn)CRC生長的機(jī)制，為XRCC5成為CRC治療靶點提供了理論及實驗依據(jù)。
　　第一部分 XRCC5作為COX-2啟動子區(qū)結(jié)合蛋白調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞中COX-2表達(dá)
　　目的：
　　在結(jié)腸癌細(xì)胞中通過生物素-鏈霉親和素垂釣實驗尋找并鑒定

15、與COX-2啟動子區(qū)特異性結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白，并驗證該調(diào)節(jié)蛋白對結(jié)腸癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響。
　　方法：
　　為了鑒定潛在的COX-2啟動子區(qū)特異性結(jié)合蛋白，我們設(shè)計了一段478bp（-30至-508）生物素標(biāo)記的雙鏈DNA探針。應(yīng)用生物素-鏈霉親和素垂釣實驗在四種結(jié)腸癌細(xì)胞系（RKO、LoVo、DLD-1和SW480）中分離出COX-2啟動子區(qū)特異性結(jié)合蛋白復(fù)合物。對該蛋白復(fù)合物進(jìn)行洗脫沉淀，采用SDS-PAGE及銀染顯色

16、顯示可能的COX-2啟動子區(qū)特異性結(jié)合蛋白條帶。對可能的條帶進(jìn)行酶解，并應(yīng)用質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對鑒定蛋白。通過RT-PCR及Western blot判斷發(fā)現(xiàn)的蛋白及COX-2在四種結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。在LoVo細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)應(yīng)用siRNA敲低該鑒定出的蛋白表達(dá)水平，并共轉(zhuǎn)染COX-2啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告基因，進(jìn)而驗證該鑒定出的蛋白對COX-2啟動子區(qū)的特異性結(jié)合作用及敲低該蛋白對COX-2啟動子區(qū)激活的抑制作用。在上

17、述共轉(zhuǎn)染體系中，通過LPS誘導(dǎo)COX-2表達(dá)，進(jìn)而驗證COX-2誘導(dǎo)劑是否可以拮抗敲低該蛋白對COX-2啟動子區(qū)激活的抑制作用。在LoVo及RKO細(xì)胞中，應(yīng)用免疫熒光定位實驗確定該鑒定的蛋白是否位于細(xì)胞核，進(jìn)一步驗證該鑒定的蛋白是否在COX-2轉(zhuǎn)錄過程中扮演轉(zhuǎn)錄因子角色。在LoVo及RKO細(xì)胞中，通過siRNA敲低該蛋白表達(dá)，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)該蛋白表達(dá)，并應(yīng)用Western blot鑒定COX-2蛋白表達(dá)變化，進(jìn)一步驗證該蛋白對COX-

18、2蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.生物素-鏈霉親和素垂釣實驗分離出COX-2啟動子區(qū)特異性結(jié)合蛋白復(fù)合物，經(jīng)SDS-PAGE及銀染發(fā)現(xiàn)分子量約90kD的蛋白條帶。質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對鑒定出該蛋白為XRCC5。
　　2. RT-PCR及Western blot提示四種結(jié)腸癌細(xì)胞系中XRCC5及COX-2在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均呈高表達(dá)。
　　3.在LoVo細(xì)胞中，敲低XRCC5表達(dá)明顯降低其對COX-2啟

19、動子區(qū)的激活作用。COX-2誘導(dǎo)劑LPS拮抗敲低XRCC5表達(dá)對COX-2啟動子區(qū)激活的抑制作用。
　　4.在LoVo及RKO細(xì)胞中，應(yīng)用免疫熒光定位實驗確定XRCC5位于細(xì)胞核。5.在蛋白表達(dá)水平，敲低XRCC5明顯降低COX-2蛋白表達(dá)水平，而上調(diào)XRCC5表達(dá)明顯升高COX-2蛋白表達(dá)水平。XRCC5對COX-2表達(dá)具有正調(diào)控作用。
　　結(jié)論：在結(jié)腸癌細(xì)胞中，XRCC5是特異性的COX-2啟動子區(qū)結(jié)合蛋白；XRCC5與

20、COX-2啟動子區(qū)結(jié)合可以激活COX-2啟動子，并促進(jìn)COX-2轉(zhuǎn)錄。結(jié)腸癌細(xì)胞中XRCC5在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均呈高表達(dá)，XRCC5是結(jié)直腸癌的促癌因子。XRCC5在蛋白水平對COX-2具有調(diào)控作用，且該調(diào)控作用為正向調(diào)控。
　　第二部分轉(zhuǎn)錄共活化子p300通過乙?；疿RCC5協(xié)同調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞中COX-2表達(dá)
　　目的：
　　通過免疫共沉淀方法探討XRCC5與轉(zhuǎn)錄共活化子p300是否存在相互作用。通過調(diào)控p300在

21、結(jié)腸癌細(xì)胞中的水平及其乙?；δ?，進(jìn)一步明確p300是否通過乙?；疿RCC5協(xié)同調(diào)控COX2表達(dá)。
　　方法：
　　提取RKO、LoVo及SW480結(jié)腸癌細(xì)胞核蛋白，應(yīng)用XRCC5抗體進(jìn)行免疫共沉淀，分離出含有XRCC5的免疫復(fù)合物，應(yīng)用Western blot檢測p300抗體是否與該免疫復(fù)合物結(jié)合。同時，應(yīng)用p300抗體進(jìn)行免疫共沉淀，分離出含有p300的免疫復(fù)合物，應(yīng)用Western blot檢測XRCC5抗體是否與該免

22、疫復(fù)合物結(jié)合。通過上述實驗驗證XRCC5蛋白與p300蛋白是否存在相互作用。應(yīng)用免疫熒光定位實驗確定XRCC5與p300是否位于細(xì)胞核同一位置，進(jìn)一步驗證兩者的相關(guān)性。通過Western blot檢測RKO、LoVo及SW480結(jié)腸癌細(xì)胞核蛋白乙?；疿RCC5表達(dá)情況。通過轉(zhuǎn)染p300過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)p300表達(dá)，利用p300乙?；敢种苿〤646抑制p300乙?；饔谩６?，應(yīng)用乙?；贵w免疫共沉淀核蛋白，利用Western blot檢

23、測該免疫復(fù)合物中XRCC5及乙酰化XRCC5的表達(dá)，驗證P300對XRCC5乙酰化的作用。對結(jié)腸癌細(xì)胞上調(diào)p300表達(dá)或應(yīng)用C646抑制p300乙?；饔?，Western blot檢測COX-2表達(dá)情況，驗證p300乙?；疿RCC5對COX-2表達(dá)的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用XRCC5抗體進(jìn)行免疫共沉淀得到的免疫復(fù)合物可以檢測到p300蛋白。而應(yīng)用p300抗體進(jìn)行免疫共沉淀得到的免疫復(fù)合物可以檢測到XRCC5蛋白。

24、
　　2.免疫熒光定位實驗表明，XRCC5蛋白與p300蛋白均在結(jié)腸癌細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，兩者位置一致。
　　3. RKO、LoVo及SW480結(jié)腸癌細(xì)胞核蛋白中均存在大量的乙?；疿RCC5表達(dá)。上調(diào)p300表達(dá)并不增加XRCC5表達(dá)，但可以增加XRCC5乙?；剑种苝300乙?；饔脛t降低XRCC5乙?；?。上調(diào)p300表達(dá)可以增加COX-2表達(dá)，而抑制p300乙?；饔脛t降低COX-2表達(dá)。
　　結(jié)論：
　

25、　XRCC5與轉(zhuǎn)錄共活化子p300在結(jié)腸癌細(xì)胞核內(nèi)存在相互作用，p300通過乙?；疿RCC5協(xié)同調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞COX-2表達(dá)。
　　第三部分XRCC5及p300協(xié)同調(diào)控COX-2表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及腫瘤生長
　　目的：
　　通過細(xì)胞增殖實驗及動物成瘤實驗探討XRCC5調(diào)控COX-2促進(jìn)結(jié)腸癌生長的作用。通過調(diào)控XRCC5及p300乙?；δ?，驗證XRCC5及p300協(xié)同調(diào)控COX-2并影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用。

26、r>　　方法：
　　在 LoVo及RKO細(xì)胞中，通過siRNA敲低XRCC5表達(dá)，應(yīng)用MTS方法鑒定結(jié)腸癌細(xì)胞活力，應(yīng)用克隆形成實驗鑒定結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力，通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，研究敲低XRCC5表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響。通過轉(zhuǎn)染XRCC5過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)XRCC5表達(dá)，采用MTS方法鑒定結(jié)腸癌細(xì)胞活力，明確上調(diào)XRCC5對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用。在 LoVo及RKO細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)染XRCC5過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)XRCC5表達(dá)，應(yīng)

27、用MTS方法判定結(jié)腸癌細(xì)胞活力，證明XRCC5對結(jié)腸癌生長的促進(jìn)作用。而后，應(yīng)用COX-2抑制劑塞來昔布抑制COX-2表達(dá)，通過MTS實驗鑒定結(jié)腸癌細(xì)胞活力，明確COX-2抑制劑是否具有拮抗XRCC5促進(jìn)結(jié)腸癌生長的作用，進(jìn)而在體外驗證XRCC5通過調(diào)控COX-2影響結(jié)腸癌生長。應(yīng)用裸鼠成瘤實驗，研究siRNA敲低XRCC5表達(dá)對結(jié)腸癌在裸鼠體內(nèi)生長的抑制作用，并觀察COX-2誘導(dǎo)劑LPS是否可以拮抗該抑制作用，進(jìn)而在動物中驗證XRCC

28、5通過調(diào)控COX-2影響結(jié)腸癌生長。上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞p300表達(dá)，應(yīng)用MTS觀察結(jié)腸癌細(xì)胞活力，驗證p300對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的促進(jìn)作用。同時上調(diào)p300表達(dá)和敲低XRCC5表達(dá)，應(yīng)用MTS觀察結(jié)腸癌細(xì)胞活力，研究敲低XRCC5拮抗p300的促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用，證明p300通過XRCC5影響結(jié)腸癌細(xì)胞生長。同時抑制p300乙?；饔煤蜕险{(diào)XRCC5表達(dá)，應(yīng)用MTS觀察結(jié)腸癌細(xì)胞活力，驗證p300乙?；种苿┺卓筙RCC5促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞

29、生長的作用，證明p300通過乙?；疿RCC5促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長。
　　結(jié)果：
　　1. MTS實驗表明，通過siRNA敲低XRCC5表達(dá)可以明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞活力，而轉(zhuǎn)染XRCC5過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)XRCC5表達(dá)可以明顯增加結(jié)腸癌細(xì)胞活力。
　　2.顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察表明，經(jīng)siRNA敲低XRCC5表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞貼壁減少，細(xì)胞碎片增多?？寺⌒纬蓪嶒灡砻?，通過siRNA敲低XRCC5表達(dá)可以明顯降低結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成能

30、力。
　　3.轉(zhuǎn)染XRCC5過表達(dá)質(zhì)?？梢源龠M(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長，COX-2抑制劑塞來昔布可以拮抗XRCC5促進(jìn)結(jié)腸癌生長的作用，這在體外證明了XRCC5通過COX-2促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長。
　　4.裸鼠成瘤實驗表明，siRNA敲低XRCC5表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌生長，而應(yīng)用COX-2誘導(dǎo)劑LPS可以拮抗該抑制作用，這在體內(nèi)證明了XRCC5通過COX-2促進(jìn)結(jié)腸癌生長。
　　5.上調(diào)p300表達(dá)明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長。敲低XRC

31、C5可以拮抗p300促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用。抑制p300乙?；饔猛瑯涌梢栽谝欢ǔ潭壬限卓筙RCC5的促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用。這表明p300通過乙酰化XRCC5促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長。
　　結(jié)論：
　　體內(nèi)實驗及體外實驗表明，XRCC5通過COX-2促進(jìn)結(jié)腸癌生長。而p300則通過乙?；疿RCC5促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長。p300通過對XRCC5的乙?；饔门cXRCC5協(xié)同調(diào)控COX-2表達(dá)，進(jìn)而影響結(jié)腸癌生長。我們的實驗結(jié)果為X