塞來昔布作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞GRP78與P-Akt相互作用的實驗研究.pdf

1、目的：研究塞來昔布（celecoxib）作用人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480與DLD-1時GRP78與P-Akt的相互作用。
　　方法：以人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、DLD-1為研究對象，塞來昔布依不同濃度（0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,60μmol/L,80μmol/L,100μmol/L）作用一定時間（24h）或以一定濃度的塞來昔布（100μmol/L）作用不同時間（0h,1h,3h,6h,12h,

2、24h,48h）,采用MTT法測定塞來昔布對SW480、DLD-1生長的抑制作用。接著，塞來昔布（100μmol/L）作用一定時間（0h,1h,3h,6h,12h,24h）利用Real-time PCR、Western blot檢測SW480、DLD-1細(xì)胞PI3K/Akt通路中P-Akt與UPR標(biāo)志分子GRP78表達量的變化情況。然后，分別通過PI3K抑制劑LY294002抑制P-Akt；通過RNA干擾技術(shù)設(shè)計GRP78 siRNA分

3、別轉(zhuǎn)染SW480、DLD-1細(xì)胞以抑制GRP78表達。利用Real-timePCR、Western blot檢測各細(xì)胞P-Akt與UPR相關(guān)指標(biāo)（GRP78、CHOP）、線粒體凋亡通路（Bcl-2、Bax）表達量的變化。細(xì)胞凋亡的檢測由流式細(xì)胞儀完成。
　　結(jié)果：
　　1.MTT法結(jié)果顯示塞來昔布對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制率隨作用時間與作用濃度的增加而顯著加強，*P<0.05（差異有統(tǒng)計學(xué)意義）;
　　2.塞來昔布作用下誘

4、導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生 UPR，其標(biāo)志性分子 GRP78表達升高(*P<0.05)，而P-Akt初期先逐漸升高（6小時達最高），后逐漸降低(*P<0.05)。3.抑制結(jié)腸癌細(xì)胞P-Akt，GRP78表達量明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05)；
　　4.抑制初期（6小時）反應(yīng)性升高的P-Akt，利用流式檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率顯著增加（*P<0.05）。
　　5.下調(diào) GRP78的表達量，與對照組相比，初期（6小時） P-Akt表

5、達下降(*P<0.05)；后期（24小時） P-Akt表達增加(*P<0.05)。
　　6.下調(diào)GRP78的表達量，細(xì)胞的凋亡比率增加（*P<0.05）；CHOP表達明顯增加(*P<0.05)；線粒體凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2降低、Bax升高）發(fā)生促凋亡的相應(yīng)改變(*P<0.05)。
　　結(jié)論：塞來昔布作用于結(jié)腸癌細(xì)胞可誘發(fā)UPR，此過程中GRP78通過對P-Akt與CHOP的調(diào)節(jié)對結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生保護作用，同時P-Akt能負(fù)反