TXNDC5通過胰島素信號途徑參與類風濕關(guān)節(jié)炎病變過程的研究.pdf

1、研究背景:類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患病率為0.35％，是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)損傷和滑膜炎癥，組織病理學特征為關(guān)節(jié)滑膜細胞增殖、細胞浸潤能力增強、細胞凋亡降低、血管翳形成和大量炎性細胞浸潤。RA導致患者關(guān)節(jié)活動明顯受限甚至致軀體殘疾，嚴重威脅著人類的健康。但是該病的致病機制尚不完全明確，治療藥物也僅以抗炎藥物為主。因此，RA開展相關(guān)的細胞和分子機制的研究對RA的診治具有重要

2、意義。
　　硫氧還蛋白5(thioredoxin domain containing protein5，TXNDC5)基因編碼的蛋白質(zhì)屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族，可催化二硫鍵的重排，具有抗氧化、促進血管形成，參與細胞炎癥等多種生物功能。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，TXNDC5在RA患者的滑膜組織和血液中高表達，其編碼基因足RA的遺傳易感基因。我們的實驗動物學研究證明，TXNDC5轉(zhuǎn)基因小鼠更易于被膠原Ⅱ誘導出關(guān)節(jié)炎。因此我們建議，TXND

3、C5在RA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，雖然其具體致病機制尚不清楚。本課題研究的目的就是探索TXNDC5如何參與、影響RA的病變過程。
　　近年的基因組學及其他分子生物學研究顯示，TXNDC5是糖尿病易感基因，在糖尿病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病，常伴有胰島素抵抗或胰島素相關(guān)信號通路的異常。其他人的研究證明，TXNDC5不僅能催化胰島素二硫鍵的還原，減少胰島素的合

4、成，而且可以降低胰島素與其受體的結(jié)合活性，加劇糖尿病病情。流行病學調(diào)查也顯示，RA患者中2型糖尿病的患病風險增高，患者機體胰島素抵抗增強。另外，大量研究提示，RA的炎癥活動及炎癥介質(zhì)影響糖代謝、胰島素信號通路及胰島素抵抗相關(guān)通路，進而提高了RA患者罹患糖尿病的風險。鑒于RA與糖尿病患病風險的關(guān)系以及TXNDC5在兩種疾病中的重要作用，提示我們TXNDC5有可能通過胰島素相關(guān)信號通路參與RA的發(fā)生發(fā)展。因此，本課題計劃探索TXNDC5是否

5、通過胰島素信號途徑參與RA病變過程，分析TXNDC5與胰島素抵抗、胰島素信號通路相關(guān)基因之間的關(guān)系。本課題也計劃在分子水平上了解RA與糖尿病之間的內(nèi)在聯(lián)系。
　　目的:類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞(rheumatoid arthritis synovial cells，RASFs)是RA關(guān)節(jié)滑膜中的重要組成成分，有顯著增強的增殖能力，可分泌多種炎癥因子和生長因子，促進RA滑膜炎和關(guān)節(jié)組織破壞過程。為了研究TXNDC5對RA的致病機制和作用

6、，本課題酋先用小分子RNA抑制RASFs中TXNDC5的表達，然后觀察細胞的增殖、遷移和凋亡變化情況。同時，用PCR array分析anti-TXNDC5siRNA處理的RASFs，篩選TXNDC5在RASFs中參與胰島素抵抗或者胰島素信號通路的相關(guān)基因，然后用Real-time PCR、ELISA、Western blot等方法驗證PCRarray結(jié)果。PCR array是近幾年興起的快速篩選信號途徑和疾病關(guān)聯(lián)基因的技術(shù)。該技術(shù)把一信

7、號途徑或一疾病所用相關(guān)基因裝載在一芯片上，通過Real-timePCR技術(shù)一次性篩選到目的基因。
　　方法:采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將針對TXNDC5小干擾RNA(siRNA)導入在RASFs中，抑制TXNDC5的表達，然后采用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測TXNDC5的mRNA和蛋白表達水平;采用CCK8增殖實驗、細胞遷移實驗以及流式細胞術(shù)分別檢測抗TXNDC5 siRNA處理組（anti-TXNDC5

8、siRNA組）RASFs的增殖、遷移和凋亡，對照組包括空白對照組、陰性對照組（Allstar siRNA處理組）;采用insulin resistance RT2 Profiler PCR Array和insulin signaling pathwayRT2 Profiler PCR Array分別分析anti-TXNDC5 siRNA轉(zhuǎn)染的RASFs和AllstarsiRNA轉(zhuǎn)染的RASFs，通過比較相關(guān)基因的差異表達發(fā)現(xiàn)TXNDC5

9、的下游調(diào)控基因;采用Real-time PCR和ELISA法驗證PCR array結(jié)果;采用Real-time PCR和Western blot檢測RA和骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)滑膜組織中IGFBP1（insulin like growth factor binding protein1）的表達水平。
　　結(jié)果:實驗結(jié)果顯示，抑制TXNDC5的表達后，RASFs細胞的增殖(P=0.003)和遷移能力（P=0.

10、002）明顯降低，凋亡明顯增加（P=0.006）;PCR Array在anti-TXNDC5 siRNA組和Allstar siRNA組中共檢測到5個差異表達的基因，其中insulin resistance RT2 Profiler PCR Array篩選出IGF-1(insulin like growthfactor-1)、PCK1(phosphoenolpyruvate carboxykinase1)、SLC2A4(solute c

11、arrierfamily2 member4)和IL1R1(interleukin1 receptor type1)基因，insulin signalingpathway RT2 Profiler PCR Array篩選出IGFBP1基因。Real-time PCR驗證上述結(jié)果，證實I GFBP1在anti-TXNDC5 siRNA組中顯著增高(P=0.005)，而IGF-1、PCK1、SLC2A4和IL1R1的表達在兩組間差異沒有統(tǒng)計學

12、意義;ELISA證實IGFBP1的蛋白水平在anti-TXNDC5 siRNA轉(zhuǎn)染RASFs的細胞培養(yǎng)液中顯著增高(P＜0.001);由于有文獻報道IGFBP3(insulin like growth factor binding protein3)在RASFs中表達，并在IGF信號途徑中發(fā)揮重要作用，而且IGFBP3與IGFBP1的功能十分相似，都是IGF-1重要的結(jié)合蛋白，我們也用Real-time PCR檢測IGFBP3的表達水平

13、。結(jié)果顯示，IGFBP3的表達在兩組間沒有差異;Real-time PCR分析了人RA和OA組織中IGFBP1的表達，結(jié)果顯示RA滑膜組織中IGFBP1的mRNA表達明顯低于OA滑膜組織(P=0.011)。同樣，Western blot結(jié)果顯示RA組織中IGFBP1的蛋白表達較OA組織中明顯降低(P=0.014)。實驗結(jié)果顯示，抑制RASFs中TXNDC5的表達后，IGFBP1的表達量增高，而IGF-1和IGFBP3的表達并未發(fā)生變化。

14、Westem blot結(jié)果顯示相對于OA滑膜組織，RA滑膜組織中IGFBP1表達降低。
　　結(jié)論:以上結(jié)果顯示，RASFs中TXNDC5被抑制后，IGFBP1的表達增加。我們前期工作已證明RA滑膜組織中高表達TXNDC5。因此，本研究結(jié)果建議，RASFs高表達TXNDC5可能會抑制IGFBP1的表達。由于IGFBP與IGF-1結(jié)合可以抑制IGF活性。因此，我們的結(jié)果還建議RA滑膜中高表達的TXNDC5通過抑制IGFBP1表達增加I

15、GF-1/IGFBP1比值而提高1GF-1的活性。已有報道，IGF-1具有促炎和抑制細胞凋亡的作用，并且還能促進多種細胞的增殖、分化及遷移。本研究發(fā)現(xiàn)抑制TXNDC5表達后，RASFs細胞增殖、遷移能力降低，凋亡率增加。這可能是由于增高的IGFBP1抑制了IGF-1的活性致使細胞的行為發(fā)生改變?？傊?，結(jié)合以前的工作和本研究的結(jié)果，我們建議TXNDC5參與RA病變過程如下:TXNDC5在RA滑膜細胞中高表達，通過抑制IGFBP1表達而不是

16、IGFBP3刺激IGF-1活性，從而增強RASFs增殖、浸潤能力并抑制細胞凋亡，結(jié)果促進RA的病程進展。本研究在RA滑膜組織中發(fā)現(xiàn)IGFBP1低表達也證明了該建議。另外，有人也發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血液中IGFBP1表達水平明顯異常、IGF-1活性明顯變化。本研究的結(jié)果也建議TXNDC5以及對IGFBP1表達的調(diào)控可能是RA與糖尿病之間內(nèi)在聯(lián)系的重要分子機制。TXNDC5負向調(diào)控IGFBP1表達以及影響RASFs細胞功能的發(fā)現(xiàn)，為研究RA的發(fā)病