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文檔簡介
1、研究背景:
感音神經(jīng)性聾是一種較為常見的聲波感受和聲波傳導障礙性疾病,多為重度耳聾。該病的病變常常發(fā)生于柯蒂氏器的內外毛細胞、聽神經(jīng)及各級聽中樞,患者對于聲音的感受與神經(jīng)沖動的傳導發(fā)生障礙,從而引起聽力的下降。感音神經(jīng)性耳聾極大的影響了患者的生活質量。感音神經(jīng)性耳聾分為感音性耳聾(病變位于毛細胞,又稱耳蝸性聾)和神經(jīng)性耳聾(病變位于聽神經(jīng)及其傳導通路,又稱蝸后性聾)。蝸后性耳聾由于神經(jīng)細胞的缺乏自我修復的能力而很難治愈。對于感
2、音神經(jīng)性聾的恢復策略,最新的探索表明干細胞植入是潛在的治療手段。干細胞具有多向分化能力,有分化為新的毛細胞、神經(jīng)細胞和支持細胞的潛能。許多研究都表明,Wnt信號通路對于神經(jīng)干細胞的增殖發(fā)揮著決定性作用。并且,Wnt信號通路的激活有可能可以使非神經(jīng)元細胞再次進入細胞周期轉變?yōu)樯窠?jīng)元細胞,這就使得治療蝸后性聾成為了可能。
Wnt信號通路是一種在進化中高度保守的信號通路,在多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌
3、的與細胞膜上的受體結合,激活下游的信號通路,調節(jié)靶基因的表達從而影響著極細胞、干細胞等的細胞增殖、分化與凋亡的過程。通路的異常激活往往與腫瘤的發(fā)生有關。Wnt信號通路分為兩種,經(jīng)典的Wnt信號通路和非經(jīng)典的Wnt信號通路。β-連環(huán)蛋白的富集與入核是經(jīng)典Wnt信號通路激活的標志。β-連環(huán)蛋白入核后與轉錄因子結合從而調節(jié)下游目的基因的表達。而非經(jīng)典的Wnt信號通路,不依賴于β-連環(huán)蛋白,是由其他的一些蛋白或離子參與構成。
耳蝸螺旋
4、神經(jīng)節(jié)細胞的缺失可引起神經(jīng)性耳聾的發(fā)生。而有大量研究表明,耳毒性藥物、噪聲、缺氧、衰老等常見損傷,均可造成小鼠耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡,造成耳聾。而目前對于耳毒性藥物的研究,較多集中在順鉑等藥物。紫杉醇由于其與順鉑常常聯(lián)合使用,其耳毒性往往為順鉑所掩蓋,研究較少。而研究也表明紫杉醇確實具有神經(jīng)毒性,可以猜測紫杉醇的耳毒性是對耳的神經(jīng)細胞造成了影響。螺旋神經(jīng)節(jié)作為聽覺通路的第一級神經(jīng)元,有理由懷疑紫杉醇對于螺旋神經(jīng)節(jié)有損傷作用而這
5、一作用正是它耳毒性的原因。本研究通過組織培養(yǎng)的方式來探究紫杉醇對于螺旋神經(jīng)節(jié)是否具有獨立的損傷作用,并探討Wnt信號通路對于紫杉醇的作用是否具有一定的影響。
實驗目的:
以C57BL/6小鼠作為研究對象,探討紫杉醇本身是否對小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生獨立的損傷作用,若有損傷,則進一步探討其機制及Wnt信號通路在此過程中的作用。
實驗方法:
1.選取出生后3天(p3)野生型的C57BL/6品系小鼠為研究
6、對象,取小鼠耳蝸中轉(帶螺旋神經(jīng)節(jié))分組進行原代培養(yǎng)。
2.分別使用不同濃度紫杉醇培養(yǎng),利用MTT法測定細胞存活程度,并選取合適濃度進行進一步實驗。將小鼠耳蝸中轉隨機分為四組,分別使用培基(不加藥的空白對照)、紫杉醇、紫杉醇+Wnt信號通路激動劑(Wnt3a)、紫杉醇+Wnt信號通路抑制劑(IWP2)來處理中轉(帶螺旋神經(jīng)節(jié))48h,之后分別進行免疫熒光染色和TUNEL染色,觀察螺旋神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)纖維的變化。使用蛋白印跡試驗(W
7、estern blot)來印證免疫熒光染色的實驗結果。
3.紫杉醇腹腔注射一月齡小鼠,測聽后解剖,取耳蝸制作冰凍切片進行免疫熒光染色,觀察螺旋神經(jīng)節(jié)的變化。
實驗結果:
1.MTT結果顯示,1μl紫杉醇即可造成細胞存活率的下降,紫杉醇對螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷呈現(xiàn)濃度依賴,后續(xù)實驗選用30μl濃度進行。免疫熒光染色顯示,紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)結構被破壞,細胞數(shù)量減少,神經(jīng)纖維數(shù)量減少。
2.免疫熒光染色顯示紫
8、杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)破壞,出現(xiàn)了胞質致密,染色質邊集,核固縮及凋亡小體等凋亡表現(xiàn)。而TUNEL染色證實了凋亡的存在。
3.免疫熒光染色顯示紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞Caspase-3染色陽性。蛋白印跡試驗也證實了Caspase-3的表達增多。
4.加入Wnt信號通路激動劑組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量介于對照組和紫杉醇組之間,形態(tài)較紫杉醇組稍好,神經(jīng)纖維基本整齊排列。加入抑制劑組螺旋神經(jīng)節(jié)結構嚴重破壞,細胞數(shù)量大量少,形態(tài)破壞
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