腸系膜淋巴結(jié)CD169+巨噬細胞在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　炎癥性腸疾病(inflammatory bowel disease，IBD)，是一種主要發(fā)生在腸道的慢性的，易復(fù)發(fā)的免疫性疾病，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)是IBD的兩種最主要的發(fā)病形式，發(fā)病時伴隨反復(fù)腹痛不適，疲乏，黏液性血便等。雖然環(huán)境因素，腸道微生物菌群，遺傳因素以及免疫系統(tǒng)的相關(guān)作用，在IBD的發(fā)病過程中均起到一定的作用，但是其

2、具體的機制還不完全清楚。近年來，IBD的發(fā)病率在全球逐漸升高，且長期患有IBD的患者極易誘發(fā)結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)。
　　天然免疫和適應(yīng)性免疫在IBD的發(fā)病中都起著顯著的作用，其中腸道組織不同的巨噬細胞亞群在不同的條件下其功能具有多樣性。CD169(唾液酸黏附素，Siglec-1)是唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)家族的第一個成員，可特異性識別唾液酸配基，在小鼠體內(nèi)主要表達在次級淋巴器官

3、巨噬細胞表面，比如淋巴結(jié)被膜下淋巴竇(subcapsular sinus，SCS)，脾臟邊緣區(qū)(marginalzone)，以及淋巴組織外的其它一些部位，如結(jié)腸固有層(lamina propria，LP)。在這些部位，CD169+巨噬細胞起著哨衛(wèi)的作用，識別進入的病原體抗原，激活淋巴細胞，及抗病原體的免疫反應(yīng)。在腸道系統(tǒng)免疫反應(yīng)中，腸系膜淋巴結(jié)(mesentericlymph node，mLNs)是重要的誘導(dǎo)性位點，攜帶病原體的抗原提呈

4、細胞在淋巴結(jié)中可識別并激活天然T淋巴細胞，使其分化并增殖為炎性T淋巴細胞，比如Th1，Th2或者是Th17細胞，這些炎性T淋巴細胞可被募集至腸道組織中，促進IBD的發(fā)病。但是分布于mLNs中的CD169+巨噬細胞在黏膜免疫中的作用仍未見有詳細的報道。因此本研究致力于探索腸系膜淋巴結(jié)中CD169+巨噬細胞在IBD中的調(diào)控作用及相關(guān)機制。
　　研究目的:
　　利用DSS誘導(dǎo)的IBD動物模型，研究mLNs CD169+巨噬細胞在小

5、鼠結(jié)腸炎發(fā)病過程中的作用，探究IBD的發(fā)病原因及致病機制，從而為揭示IBD的復(fù)雜病因和病理機制提供具有學(xué)術(shù)理論價值和臨床應(yīng)用潛能的實驗數(shù)據(jù)。
　　研究方法:
　　將3.5％ DSS水溶液給予WT小鼠和CD169-DTR小鼠自由飲用，三天或七天，建立小鼠結(jié)腸炎動物模型。每天檢測小鼠的體重變化并觀察記錄小鼠的發(fā)病情況。首先，利用流式分析，免疫熒光和Q-PCR的方法檢測WT小鼠結(jié)腸炎發(fā)病過程中CD169+巨噬細胞在mLNs中的數(shù)量

6、變化，明確腸系膜淋巴結(jié)CD169+巨噬細胞在小鼠結(jié)腸炎的發(fā)病過程中起著重要的作用。然后，運用流式，Q-PCR和免疫熒光的方法檢測注射白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)對CD169-DTR小鼠中CD169+巨噬細胞特異性刪除效果，對WT小鼠和CD169-DTR小鼠結(jié)腸炎模型，進行組織學(xué)和病理學(xué)比較，明確腸系膜淋巴結(jié)CD169+巨噬細胞對結(jié)腸炎發(fā)病的作用。最后，通過流式，Q-PCR，ELISA的方法檢測兩種模型腸系膜淋巴結(jié)炎

7、性細胞數(shù)量變化和細胞因子趨化因子的表達變化，探究CD169+巨噬細胞調(diào)控結(jié)腸炎發(fā)病的作用機制。
　　研究結(jié)果:
　　首先，DSS能夠成功的誘導(dǎo)WT小鼠結(jié)腸炎模型，結(jié)果顯示，與正常飼養(yǎng)的小鼠相比，給予DSS的小鼠mLNs中，浸潤的炎性細胞數(shù)量明顯增多，炎性細胞因子如IL-17，IL-21，IL-23，IL-6，IL-1β，TNF-α，IL-12，IL-18和趨化因子如CCL8，CCL3表達量顯著升高，抑炎性的趨化因子CCL22

8、表達量明顯降低。而且， mLNs CD169+巨噬細胞的比例明顯增加，免疫熒光實驗揭示CD11b+CD169+巨噬細胞主要分布于腸系膜淋巴結(jié)被膜下淋巴竇的區(qū)域。但是，在DT注射的CD169-DTR小鼠中，CD169+巨噬細胞的數(shù)量明顯下降，和WT小鼠結(jié)腸炎模型相比，給予DSS的CD169-DTR小鼠體重下降程度，結(jié)腸縮短長度，及結(jié)腸組織損傷程度明顯降低，而且mLNs中炎性細胞浸潤明顯減少，即DSS不能成功誘導(dǎo)小鼠建立典型的結(jié)腸炎模型，揭

9、示CD169+巨噬細胞在IBD的發(fā)病進程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，和WT結(jié)腸炎小鼠mLNs相比，CD169-DTR小鼠mLNs中CCL22表達水平明顯升高，Th17細胞相關(guān)的細胞因子如IL-17，IL-23，IL-21表達水平和Th17細胞的數(shù)量顯著下降。并且體外實驗證明，WT結(jié)腸炎小鼠mLNs和結(jié)腸組織的培養(yǎng)上清可以促進CD169-DTR小鼠mLNs細胞和結(jié)腸組織炎性細胞因子，如IL-17，TNF-α，IL-1β和趨化因子

10、如CCL8，CCL3的表達，但是卻抑制了CD169-DTR小鼠mLNs細胞CCL22的表達。流式分選實驗進一步證明CD169+巨噬細胞能夠主導(dǎo)性的分泌炎性細胞因子，如IL-17，TNF-α，IL-1β。
　　結(jié)論:
　　本課題的研究結(jié)果表明在小鼠結(jié)腸炎模型中，mLNs腸系膜淋巴結(jié)被膜下淋巴竇(SCS) CD169+巨噬細胞在黏膜炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用，mLNs中的CD169+巨噬細胞亞群在結(jié)腸炎模型中的數(shù)量顯著升