9型腺相關病毒介導CaMEK基因轉染增強心肌細胞ERK1-2通路表達活性的研究.pdf

1、目的：以重組9型腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus serotyoe9，rAAV9）為載體介導CaMEK基因轉染心肌細胞，觀察是否能增強心肌細胞ERK1/2通路表達活性，進而減輕心肌細胞凋亡，促進細胞存活。
　　方法：分離培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，用含不同啟動子的rAAV9轉染分離所得心肌細胞，流式細胞儀及Western blot測定各組細胞的轉染效率，選擇適宜啟動子，并檢測 rAAV9的心肌

2、特異性轉染。rAAV9介導CaMEK基因轉染心肌細胞，Western blot檢測各組細胞ERK1/2通路相關蛋白及轉錄因子的表達，免疫熒光定位檢測 ERK1/2通路相關信號分子的轉位激活。星胞菌素誘導心肌細胞凋亡，Western blot檢測各組細胞凋亡相關蛋白的表達，Hoechst33342染色從形態(tài)學上評價各組細胞凋亡狀況。
　　結果：（1）流式結果顯示CBA啟動子和CMV啟動子介導的rAAV9在心肌細胞的轉染效率分別為（9

3、1.5±1.0）％和（73.2±1.3）%（P＜0.05），Western blot結果顯示rAAV9-CBA-eGFP組eGFP蛋白的表達明顯強于rAAV9-CMV-eGFP組。（2）倒置熒光顯微鏡及Western blot結果均顯示rAAV9-CBA-eGFP可特異性轉染心肌細胞，eGFP的表達高峰在第5天。（3） Western blot結果顯示rAAV9-eGFP-CaMEK轉染心肌細胞可高效活化ERK1/2通路相關蛋白及轉錄因

4、子的表達。免疫熒光定位檢測發(fā)現(xiàn)，rAAV9-eGFP-CaMEK轉染組，P-ERK1/2發(fā)生核轉位。（4）Western blot結果顯示，rAAV9介導CaMEK基因轉導可有效減輕星胞菌素誘導的心肌細胞凋亡，并且這種抗凋亡作用有可能正是通過激活ERK1/2通路來實現(xiàn)的。
　　結論：CBA啟動子介導的rAAV9載體可特異性且高效的轉染心肌細胞，在心肌細胞的表達高峰在第5天。rAAV9介導CaMEK基因轉染可增強心肌細胞 ERK1/