肝素相關(guān)結(jié)構(gòu)修飾酶的克隆、表達(dá)及其酶活分析.pdf

1、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)在各種蛋白聚糖中最具生物活性，參與細(xì)胞增殖分化、炎癥反應(yīng)、病原微生物感染以及抗凝血等多種生物進(jìn)程。其生物活性受多種因素的影響，包括硫酸乙酰肝素殘基上不同位點(diǎn)的硫酸化和異構(gòu)體化，本研究對能夠改變肝素多糖結(jié)構(gòu)的各種修飾酶展開研究，為進(jìn)一步探索HSPG的構(gòu)效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，而且對于開辟新的抗血栓，抗病毒，抗癌用藥，具有十分重要的意義。本文主要研究內(nèi)容如下：
　　 以肝素黃桿菌為出發(fā)菌株，通過對Genen

2、Bank登錄的肝素黃桿菌來源的2-O位脫硫酸基酶(2-O-sulfatase)與6-O位脫硫酸基酶(6-O-sulfatase)基因序列分析，設(shè)計(jì)并合成PCR引物，利用RT-PCR技術(shù)成功克隆了2-O-sulfatase與6-O-sulfatase成熟肽編碼區(qū)，然后分別將其克隆到表達(dá)載體PET-28a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PET-2S，PET-6S，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，依次經(jīng)過抗生素篩選，提取質(zhì)粒PCR驗(yàn)證得到陽性克隆

3、，然后通過測序確定了其正確性。
　　 將所構(gòu)建的2-O-sulfatase與6-O-sulfatase重組菌株，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)，由于質(zhì)粒PET-28a(+)本身帶有6×組氨酸標(biāo)簽，采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱一步純化，就可以得到純度大于90％的重組蛋白。SDS-PAGE電泳檢測表明，2-O-sulfatase與6-O-sulfatase分別在49KD，61KD獲得了可溶性表達(dá)。
　　 Arixtra為肝素與凝血X

4、a因子結(jié)合部位的五糖衍生物，是最簡單的抗栓藥物，具有高選擇抗FXa活性。采用前面所制備2-O-sulfatase與6-O-sulfatase的重組蛋白，分別對Arixtra進(jìn)行2-O位與6-O位脫硫酸基團(tuán)修飾，得到2-DeA，6-DeA，2，6-DeA，經(jīng)過Bio-gel P2柱純化后，進(jìn)行抗FXa活性測定，結(jié)果顯示脫掉硫酸基的Arixtra衍生物，其抗FXa活性明顯降低，初步驗(yàn)證了2-O-sulfatase與6-O-sulfatase

5、能夠脫掉肝素寡糖結(jié)構(gòu)上特定位點(diǎn)硫酸基團(tuán)的活性。
　　 將實(shí)驗(yàn)室保存的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建高效生產(chǎn)可溶性的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的基因工程菌株。經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)，分別在43KD，88KD，76KD獲得了可溶性表達(dá)。以肝素鈉為底物，通過A232法分別進(jìn)行活性測定，均有良好的活性。
　　 以肝素鈉為底物，采用前面所表達(dá)的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別對其進(jìn)行酶解，通過改變所加酶的種類，其產(chǎn)物