6-姜烯酚通過(guò)下調(diào)PKM2的表達(dá)抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：
　　腫瘤細(xì)胞無(wú)論在缺氧還是有氧的環(huán)境下，都主要通過(guò)糖酵解途徑進(jìn)行代謝供能，這就是所謂的腫瘤有氧糖酵解，即著名的“瓦博格效應(yīng)”。大量研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞的瓦博格效應(yīng)與糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的異常活化密切相關(guān)，其中丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途徑中最容易發(fā)生異常的關(guān)鍵酶之一?，F(xiàn)代研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞中主要表達(dá)2型丙酮酸激酶(PKM2)，其過(guò)度活化促進(jìn)腫瘤糖酵解及腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移。已有研究顯示，黑色素瘤具有高度活躍的糖酵解活性，且PKM2的高

2、表達(dá)與黑色素瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后差關(guān)系密切，提示PKM2可能是抑制黑色素瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。
　　6-姜烯酚(6-Shogaol，6-SHO)是中藥干姜中的一種烷基酚類化合物，是干姜中最主要的活性成分之一，實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，且對(duì)黑色素瘤細(xì)胞糖酵解過(guò)程具有一定抑制效應(yīng)，因此，我們根據(jù)這個(gè)現(xiàn)象進(jìn)行了深入探討，6-姜烯酚是否能夠通過(guò)抑制黑色素瘤細(xì)胞的糖酵解從而抑制了黑色素瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，以進(jìn)一步揭示

3、6-姜烯酚抗黑色素瘤的分子機(jī)制。
　　方法：
　　本研究第一部分從體外細(xì)胞水平，應(yīng)用MTT、劃痕、transwell實(shí)驗(yàn)考察了6-姜烯酚對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。第二部分首先通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、葡萄糖攝取、乳酸生成實(shí)驗(yàn)考察了黑色素瘤細(xì)胞與正常皮膚細(xì)胞對(duì)糖酵解抑制劑與氧化磷酸化抑制劑的敏感性以及糖酵解水平，初步判斷黑色素瘤的代謝表型;接著考察了6-姜烯酚對(duì)黑色素瘤細(xì)胞糖酵解水平的影響;同時(shí)應(yīng)用酶活實(shí)驗(yàn)考察了6-姜烯酚對(duì)黑色素

4、瘤糖酵解過(guò)程中關(guān)鍵限速酶以及代謝產(chǎn)物的影響。
　　第三部分重點(diǎn)探討了6-姜烯酚調(diào)控2型丙酮酸激酶的機(jī)制研究，考察了6-姜烯酚對(duì)PKM2蛋白水平以及核轉(zhuǎn)位的影響，同時(shí)考察了6-姜烯酚對(duì)PKM2核內(nèi)調(diào)控蛋白STAT3蛋白表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位的影響，并對(duì)STAT3下游靶蛋白CyclinD1、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9等表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。第四部分分別從轉(zhuǎn)移瘤、皮下移植瘤兩種模型考察6-姜烯酚對(duì)黑色素瘤體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的影響，并通過(guò)HE、免

5、疫組化考察6-姜烯酚對(duì)轉(zhuǎn)移瘤與移植瘤中PKM2、p-STAT3表達(dá)的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證6-姜烯酚的抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的效應(yīng)機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　第一部分結(jié)果顯示，6-姜烯酚能劑量依賴性、時(shí)間依賴性的抑制黑色素瘤細(xì)胞(B16F10、A375)的增殖;并能一定程度上抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移與侵襲，初步表明了6-姜烯酚對(duì)黑色素瘤增殖、遷移與侵襲的具有抑制效應(yīng)。第二部分結(jié)果顯示黑色素瘤細(xì)胞對(duì)糖酵解抑制比較敏感，對(duì)氧化磷酸化抑制劑不敏

6、感，且糖酵解水平顯著高于正常皮膚細(xì)胞，初步提示黑色素瘤細(xì)胞是偏糖酵解的代謝表型。應(yīng)用6-姜烯酚干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚能抑制黑色素瘤細(xì)胞的糖酵解水平（葡萄糖攝取、乳酸生成），同時(shí)酶活實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚對(duì)糖酵解途徑中丙酮酸激酶具有一定抑制效應(yīng)。
　　第三部分結(jié)果顯示，黑色素瘤細(xì)胞中PKM2表達(dá)顯著高于正常皮膚，提示黑色素瘤細(xì)胞中PKM2的高度活化。應(yīng)用6-姜烯酚后，能抑制PKM2的蛋白表達(dá);同時(shí)發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚能逆轉(zhuǎn)PKM2激動(dòng)劑對(duì)黑色

7、素瘤細(xì)胞遷移與侵襲的促進(jìn)效應(yīng);且對(duì)PKM2核內(nèi)表達(dá)也有抑制效應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚對(duì)受PKM2調(diào)控的STAT3磷酸化有抑制效應(yīng)，并能抑制STAT3核內(nèi)磷酸化水平，對(duì)STAT3下游靶蛋白也有抑制效應(yīng)。第四部分的轉(zhuǎn)移瘤、皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6-姜烯酚對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移具有一定的抑制效應(yīng)，且能抑制轉(zhuǎn)移瘤與皮下移植瘤中的PKM2、p-STAT3的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　本課題的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干姜中的主要活性物質(zhì)6-姜烯

8、酚能通過(guò)抑制腫瘤糖酵解途徑中的PKM2，下調(diào)黑色素瘤細(xì)胞的糖酵解進(jìn)程，抑制黑色素瘤的增殖與遷移;同時(shí)6-姜烯酚能抑制黑色素瘤細(xì)胞中的STAT3活化，并且通過(guò)抑制PKM2的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)一步下調(diào)核內(nèi)STAT3的活化程度，從而抑制了黑色素瘤細(xì)胞的遷移與侵襲，發(fā)揮其抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。
　　本研究首次揭示了6-姜烯酚抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，并初步從干擾黑色素瘤糖酵解層面闡述了6-姜烯酚抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理。同時(shí)也為研究