6-姜烯酚通過下調(diào)PKM2的表達抑制黑色素瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：
　　腫瘤細胞無論在缺氧還是有氧的環(huán)境下，都主要通過糖酵解途徑進行代謝供能，這就是所謂的腫瘤有氧糖酵解，即著名的“瓦博格效應”。大量研究證實，腫瘤細胞的瓦博格效應與糖酵解途徑中關鍵酶的異?；罨芮邢嚓P，其中丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途徑中最容易發(fā)生異常的關鍵酶之一?，F(xiàn)代研究證實腫瘤細胞中主要表達2型丙酮酸激酶(PKM2)，其過度活化促進腫瘤糖酵解及腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移。已有研究顯示，黑色素瘤具有高度活躍的糖酵解活性，且PKM2的高

2、表達與黑色素瘤轉(zhuǎn)移及預后差關系密切，提示PKM2可能是抑制黑色素瘤生長與轉(zhuǎn)移的潛在靶點。
　　6-姜烯酚(6-Shogaol，6-SHO)是中藥干姜中的一種烷基酚類化合物，是干姜中最主要的活性成分之一，實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚能抑制黑色素瘤細胞的增殖，且對黑色素瘤細胞糖酵解過程具有一定抑制效應，因此，我們根據(jù)這個現(xiàn)象進行了深入探討，6-姜烯酚是否能夠通過抑制黑色素瘤細胞的糖酵解從而抑制了黑色素瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移，以進一步揭示

3、6-姜烯酚抗黑色素瘤的分子機制。
　　方法：
　　本研究第一部分從體外細胞水平，應用MTT、劃痕、transwell實驗考察了6-姜烯酚對黑色素瘤細胞生物學行為的影響。第二部分首先通過MTT實驗、葡萄糖攝取、乳酸生成實驗考察了黑色素瘤細胞與正常皮膚細胞對糖酵解抑制劑與氧化磷酸化抑制劑的敏感性以及糖酵解水平，初步判斷黑色素瘤的代謝表型;接著考察了6-姜烯酚對黑色素瘤細胞糖酵解水平的影響;同時應用酶活實驗考察了6-姜烯酚對黑色素

4、瘤糖酵解過程中關鍵限速酶以及代謝產(chǎn)物的影響。
　　第三部分重點探討了6-姜烯酚調(diào)控2型丙酮酸激酶的機制研究，考察了6-姜烯酚對PKM2蛋白水平以及核轉(zhuǎn)位的影響，同時考察了6-姜烯酚對PKM2核內(nèi)調(diào)控蛋白STAT3蛋白表達以及核轉(zhuǎn)位的影響，并對STAT3下游靶蛋白CyclinD1、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9等表達進行了驗證。第四部分分別從轉(zhuǎn)移瘤、皮下移植瘤兩種模型考察6-姜烯酚對黑色素瘤體內(nèi)生長與轉(zhuǎn)移的影響，并通過HE、免

5、疫組化考察6-姜烯酚對轉(zhuǎn)移瘤與移植瘤中PKM2、p-STAT3表達的影響，進一步驗證6-姜烯酚的抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的效應機制。
　　結(jié)果：
　　第一部分結(jié)果顯示，6-姜烯酚能劑量依賴性、時間依賴性的抑制黑色素瘤細胞(B16F10、A375)的增殖;并能一定程度上抑制黑色素瘤細胞的遷移與侵襲，初步表明了6-姜烯酚對黑色素瘤增殖、遷移與侵襲的具有抑制效應。第二部分結(jié)果顯示黑色素瘤細胞對糖酵解抑制比較敏感，對氧化磷酸化抑制劑不敏

6、感，且糖酵解水平顯著高于正常皮膚細胞，初步提示黑色素瘤細胞是偏糖酵解的代謝表型。應用6-姜烯酚干預后，發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚能抑制黑色素瘤細胞的糖酵解水平（葡萄糖攝取、乳酸生成），同時酶活實驗發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚對糖酵解途徑中丙酮酸激酶具有一定抑制效應。
　　第三部分結(jié)果顯示，黑色素瘤細胞中PKM2表達顯著高于正常皮膚，提示黑色素瘤細胞中PKM2的高度活化。應用6-姜烯酚后，能抑制PKM2的蛋白表達;同時發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚能逆轉(zhuǎn)PKM2激動劑對黑色

7、素瘤細胞遷移與侵襲的促進效應;且對PKM2核內(nèi)表達也有抑制效應。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚對受PKM2調(diào)控的STAT3磷酸化有抑制效應，并能抑制STAT3核內(nèi)磷酸化水平，對STAT3下游靶蛋白也有抑制效應。第四部分的轉(zhuǎn)移瘤、皮下移植瘤實驗結(jié)果表明，6-姜烯酚對黑色素瘤生長與轉(zhuǎn)移具有一定的抑制效應，且能抑制轉(zhuǎn)移瘤與皮下移植瘤中的PKM2、p-STAT3的表達。
　　結(jié)論：
　　本課題的實驗結(jié)果表明，干姜中的主要活性物質(zhì)6-姜烯

8、酚能通過抑制腫瘤糖酵解途徑中的PKM2，下調(diào)黑色素瘤細胞的糖酵解進程，抑制黑色素瘤的增殖與遷移;同時6-姜烯酚能抑制黑色素瘤細胞中的STAT3活化，并且通過抑制PKM2的核轉(zhuǎn)位，進一步下調(diào)核內(nèi)STAT3的活化程度，從而抑制了黑色素瘤細胞的遷移與侵襲，發(fā)揮其抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的效應。
　　本研究首次揭示了6-姜烯酚抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的效應，并初步從干擾黑色素瘤糖酵解層面闡述了6-姜烯酚抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的作用機理。同時也為研究