姬松茸子實體多糖對人白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　盡管不同治療策略的發(fā)展，白血病依舊是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，并且是人類死亡的主要原因。近年來，白血病發(fā)病率和死亡率不斷上升，針對白血病治療藥物的研究越來越重要。姬松茸，又稱為巴西蘑菇，中國也稱為梁金菇，經(jīng)過體外和體內(nèi)的研究，發(fā)現(xiàn)具有包括抗腫瘤、抗病毒、抗炎、保肝、降糖、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗過敏和免疫調(diào)節(jié)等作用。越來越多的證據(jù)表明，從姬松茸子實體中提取的多糖和多糖蛋白復(fù)合物在治療和預(yù)防癌癥上，有著很重要的生物活

2、性作用。但是，到目前為止，對于姬松茸子實體多糖對人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞體外和體內(nèi)作用的具體機(jī)制，還沒有系統(tǒng)的說明?？紤]到這一點，我們研究了姬松茸多糖體外對人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60增殖和凋亡的影響和研究多糖的體內(nèi)抑制腫瘤生長的作用。
　　細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有兩條:內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑，兩者最終都通過激活凋亡執(zhí)行分子:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinylaspartate specif

3、ic protease，Caspase)來實現(xiàn)。線粒體是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵其作用的細(xì)胞器。Bcl-2家族蛋白例如抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白和促凋亡蛋白Bax蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過程中尤其是線粒體途徑中起非常重要的作用。在內(nèi)源性線粒體途徑中，當(dāng)細(xì)胞接到凋亡信號刺激，Bax可從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，在線粒體膜上形成四聚體到十聚體組成的低聚復(fù)合物上，導(dǎo)致線粒體跨膜電位的丟失，介導(dǎo)細(xì)胞色素-c等物質(zhì)的釋放，細(xì)胞色素-c從線粒體膜間釋放

4、到細(xì)胞漿中，與凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptotic protease activating factor，Apaf-1)結(jié)合，形成凋亡體，激活Caspase-9再激活Caspase-3，啟動Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤研究的一個熱點。
　　目的:
　　1.姬松茸是食藥兼用的真菌，它的抗腫瘤活性，已被廣泛的應(yīng)用。多糖是姬松茸治療腫瘤的主要化學(xué)成分，從姬松茸子實體中

5、提取，純化出姬松茸多糖，來研究它的醫(yī)學(xué)價值。
　　2.通過觀察姬松茸多糖在體外對HL-60細(xì)胞的作用，探討姬松茸多糖抑制HL-60生長的具體機(jī)制。
　　3.通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，通過給裸鼠注射多糖樣品，來觀察其抑制腫瘤生長的效應(yīng)，檢測多糖對腫瘤細(xì)胞的殺傷或清除作用，通過計算抑瘤率等指標(biāo)來確定多糖的作用效果。
　　方法:
　　1.本實驗按照文獻(xiàn)略加改進(jìn)將500g姬松茸子實體用熱水提取、Sevage法除蛋白、乙醇沉

6、淀、離子交換層層析提純后得到姬松茸多糖，酚-硫法檢測多糖的含量。
　　2.姬松茸多糖體外誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡作用實驗研究。
　　(1)通過MTT實驗觀察姬松茸多糖對HL-60細(xì)胞的作用。
　　(2)流式細(xì)胞技術(shù)（AnnexinⅤ/PI雙染）檢測姬松茸多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。
　　(3) Caspase-3活性檢測試劑盒檢測姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Caspase-3活性的變化。
　　3.

7、姬松茸多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡具體機(jī)制的研究。
　　(1)采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測經(jīng)姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞線粒體膜電位變化情況。
　　(2)采用Western blotting方法檢測經(jīng)姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞細(xì)胞色素c(Cyt-c)、Bax蛋白、Bcl-2蛋白、聚-ADP-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP)蛋白的變化。
　　4.姬松茸多糖在體內(nèi)對裸鼠移植瘤模型

8、腫瘤的作用。
　　為了觀察姬松茸多糖在體內(nèi)對白血病細(xì)胞的作用，我們通過皮下接種HL-60細(xì)胞構(gòu)建人白血病細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型，隨機(jī)分成生理鹽水組，治療組、和環(huán)磷酰胺組，定期測量裸鼠體重，觀察裸鼠狀態(tài)和不良反應(yīng)，最后，處死裸鼠，稱量腫瘤的重量，通過計算抑瘤率等指標(biāo)來確定多糖的作用效果。
　　結(jié)果:
　　1.500g姬松茸子實體分離純化獲得42.4g粗多糖，經(jīng)過分離純化得到其中一種多糖，用酚硫法檢測其中的多糖含量為89.

9、2％
　　2.通過MTT試驗發(fā)現(xiàn)姬松茸多糖對HL-60細(xì)胞的增殖有抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，具有一定的量效關(guān)系。
　　3.流式細(xì)胞技術(shù)（AnnexinⅤ/PI雙染）檢測姬松茸多糖誘導(dǎo)人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增加，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。
　　4.通過Caspase-3活性檢測試劑盒檢測經(jīng)姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞，Caspase-3活性增加

10、，并且隨著藥物濃度的增加，活性增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。
　　5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測經(jīng)姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞線粒體膜電位變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，線粒體膜電位丟失增多，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。
　　6.Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，姬松茸多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞中細(xì)胞色素c從線粒體中釋放至細(xì)胞漿中，細(xì)胞漿中的細(xì)胞色素c增加，促凋亡因子Bax蛋白增加，同時抗凋亡蛋白Bcl-2沒有明顯變化，導(dǎo)致Bax/Bc

11、l-2比值增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。
　　7.Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞，被剪切成89KD的PARP增加，并且均隨著藥物濃度的增加，反應(yīng)增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。
　　8.姬松茸多糖裸鼠體內(nèi)抑制HL-60細(xì)胞移植瘤的生長。姬松茸多糖組裸鼠腫瘤生長受到顯著抑制，而體重?zé)o明顯差異，未觀察到明顯毒副反應(yīng)，并且隨著治療劑量的增加，抑制腫瘤生長的作用增強(qiáng)，具有一定的劑量依賴性。提示姬松茸多

12、糖在一定的劑量和療程內(nèi)具有高效、低毒的抗白血病效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1.從姬松茸子實體中通過熱水提取、乙醇沉淀、離子交換層層析提純后，可以得到姬松茸多糖。
　　2.姬松茸多糖在體外能有效的抑制HL-60細(xì)胞的增殖，同時這種抑制細(xì)胞增殖作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的，因此姬松茸多糖在體外有較強(qiáng)的體外抗白血病效應(yīng)。
　　3.本研究探明了姬松茸多糖誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過Caspase依賴的線粒體途徑調(diào)節(jié)的:在姬