金黃色葡萄球菌A型腸毒素及產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素的單克隆抗體制備及應(yīng)用.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是導(dǎo)致人和動(dòng)物腸道疾病的常見病原菌，通過產(chǎn)生腸毒素致病。腸毒素是在全球范圍內(nèi)引起食物中毒的重要原因之一，其中以金黃色葡萄球菌A型腸毒素(Staphylococcus aureus enterotoxinA，SEA)和產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(Clostridium perfringe ns enterotoxin，CPE)

2、較為常見。因此，建立一種敏感、快速的特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌A型腸毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素的方法，是進(jìn)行食品安全檢測(cè)，預(yù)防食物中毒的必要條件，具有重要的公共衛(wèi)生意義。
　　本研究旨在制備高親和力和特異性的SEA和CPE單克隆抗體和多克隆抗體，建立雙抗夾心ELISA(double antibody sandwich ELISA，DAS-ELISA)檢測(cè)方法，并試用于實(shí)際樣品檢測(cè)。
　　1.成功構(gòu)建了攜帶目的基因sea和cpe重

3、組質(zhì)粒pET-28a-sea和pET-28a-cpe，通過原核表達(dá)體系，獲得了較高純度的可溶性SEA以及CPE重組蛋白。
　　2.通過免疫小鼠、骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合、ELISA篩選和克隆化，獲得了針對(duì)SEA的單抗細(xì)胞株6株，分別命名為2C10、1G6、1F8、2A12、3D12和4C9，腹水純化效果良好，效價(jià)均大于204800。親和性分析表明，3D12的相對(duì)親和力最高，親和力常數(shù)為9.61×108L/mol，抗體亞類為IgG1。

4、
　　3.分別以腹水型單克隆抗體作為捕獲抗體，多克隆血清作為檢測(cè)抗體建立針對(duì)SEA的DAS-ELISA方法，優(yōu)化反應(yīng)條件并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:在SEA天然標(biāo)準(zhǔn)毒素濃度為2-128ng/mL范圍內(nèi)呈線性(y=1.102x-0.07，R2=0.994)，檢測(cè)下限為1.89ng/mL;鮮奶中SEA人工污染試驗(yàn)測(cè)定回收率為90％-115％，變異系數(shù)小于10％;應(yīng)用該方法對(duì)46株金葡菌水產(chǎn)品分離株和244株奶牛乳腺炎金葡菌分離株的體外培

5、養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，陽性率分別為4.4％和52.9％。
　　4.獲得了針對(duì)CPE的單抗細(xì)胞株6株，分別命名為2F8、4C8、3G6、2E11、6F9和1D12，效價(jià)均大于100萬。親和性分析表明3G6的相對(duì)親和力最高，親和力常數(shù)為7.54×109L/mol。利用CPE腹水單抗作為捕獲抗體，抗CPE兔多抗血清作為檢測(cè)抗體建立了針對(duì)CPE的DAS-ELISA檢測(cè)方法，在濃度范圍2.44-625ng/mL之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(y=0.20